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Tm值的計算公式 tm值計算方法

小知識tm值計算方法Tm值的計算公式



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Tm值的計算公式 tm值計算方法

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做過分子實驗的人都知道 ， 要想做的有效率有質量是很苦逼的 ， 1個月做100個克隆那都是小case ， 沒點看家的本事怎么行 。如果再遇到比較極品的稀有基因 ， 周旋個把月 ， 那也是家常便飯 。下面就和大家分享一些載體構建的經驗 ， 從此邁向科研達人：
1. 準備工作
俗話說：用欲善其事 ， 必先利其器 。建議大家在做構建之前先找好工具 ， 效果事半功倍哦 。推薦兩個工具 ， 一個是oligo軟件 ， 常用于引物設計和酶切位點分析；另一個是DNAstar軟件 ， 工具極強大 ， 一款全面的生物醫學軟件 ， 用作DNA和蛋白質序列分析、重疊群拼接和基因工程管理 。
插播個笑話：聽說隔壁實驗室里有個學醫的學生來做課題 ， 很聰明很刻苦 ， 但除了他以外 ， 包括老板在內都是生物物理背景 ， 整個實驗室對分子生物就只有一個粗淺的概念 ， 這個學生就想把一個質粒上的基因插到另一個質粒上去 ， 要是我就先查查有沒有合適的酶切位點 ， 要沒有就改造一下質粒一切搞定 ， 這學生他不懂?。ㄒ氖撬习骞倘慌?nbsp;， 對這方面也不懂） ， 自己辛辛苦苦設計了PCR引物去做PCR ， P了將近5K的產物去測序 ， 結果測的結果中間有個突變 ， 要懂的就找找酶切位點 ， 從原來的替換上去 ， 然后測這下這段就行 。他呢 ， 又送去了若干了質粒一個接一個的測 ， 他光測序就要花好幾千（你得佩服她老板真有錢呀） 。這件事教育我們準備工作是多么重要 。
2. 設計引物
1) 注重要：看懂質粒圖譜！拿大家比較熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子 。
想用N1質粒 ， 設計引物就得把下游引物上的中止密碼子去掉 ， 不要辛辛苦苦的一路做下來結果根本不表達融合蛋白 ， 你就死了；C1質粒 ， 注意閱讀框 ， 要是移碼了 ， 你也死了 。而且PEGFP系列有1.2.3 ， 要弄清楚別弄竄了 。一句話 ， 要看懂你的圖譜！
其他需要注意：
設計酶切位點時要加保護堿基（大家要用T載體就當我沒說）;酶切位點設計原則：盡量用粘性末端 ， 實在不行就用一些常用平端酶 ， 如EcoRV和SnaB1等 ， 要是以后還有別的用處就多加點酶切位點 ， 曾一口氣在引物上加了五個酶切位點以防以后要用到 ， 注意計算TM值的時候要減去這些不匹配的序列；注意KOZAK序列的問題 ， 很多質粒沒有提供KOZAK序列 ， 這要在設計的時候直接在引物上加好 。擅用Gene Overlap ， 比方說加個flag標簽 ， his標簽 ， my標簽之類的 ， 直接設計三引物overlap一下就可以 ， 省得還要再多構建一步 ， 這些都是設計引物時候就要考慮好的 。引物長一點不要緊（我最喜歡兩步法了） ， 尤其是對GC比高的序列 ， 有時候引物不長PCR根本不出結果 ， 注意如果GC比較高 ， 這個時候Gene Overlap就不要做了 ， 很麻煩 ， 克隆很難挑 。沒有合適的酶切位點？很簡單 ， 用同尾酶策略 ， 比方說Bgl2和BamH1 ， Nhe1和spe1 ， Xho1和Sal1（注意連上了切不下來） ， 實在不行就平端吧 。
3. PCR擴增
如果沒有現成的質?？晒┟盖?nbsp;， PCR是最理想也是最方便的策略 。目前市面上可選擇的PCR酶實在太多 ， 每隔一段時間還會升級 ， 正常情況下 ， 高保真的taq酶都能滿足需求 。但如果遇到難PCR的高GC基因 ， 可以換不同PCR酶 ， 添加一些 DMSO ， 甘油等 ， 實在不行可以考慮Clontech的2 GC rich kit ， 價格和實力都大牛 。另外 ， 建議電泳切膠回收純化PCR產物 ， 去除一些非特異性條帶 。
4. 酶切
強烈推薦NEB的內切酶 ， 記得有一次用別家的酶切過夜 ， 結果質粒都被切碎了（當然當時質粒濃度也不高） ， 而用NEB的酶 ， 切個七十二小時仍舊一切OK ， 尤其現在NEB還推出了HF的內切酶 ， 沒有星活性而且統一都用Buffer4 。另外TAKARA的酶也還可以 。
【Tm值的計算公式 tm值計算方法】5. 連接
最常用的是NEB的T4連接酶 ， 很好用 ， 但是注意Buffer里有ATP ， 反復凍融ATP失活很快 ， 拿到buffer后就分裝 ， 10uL/管 ， 一次性使用 。
載體總量：一般來說 ， 載體濃度在20-100ng/uL較好 ， 太低的話碰撞幾率低 ， 太高的話又會產生很多非目的克隆 ， 總量從50-100ng就可以 ， 太低失敗幾率很高 ， 太高克隆太多 ， 挑克隆會很麻煩 ， 反應總體積也有講究 ， 體積太大載體和目的片段碰撞幾率太低 ， 而且對感受態細胞也是個挑戰 ， 通用10-15uL 。
載體和插入片段比例：載體和插入片段比例一般是1:7 ， 如果很難連接 ， 比如說平端連接 ， 要適當提高片段濃度 ， 同時加大比例1:10 。
6. 轉化
按照SOP做就行 ， 話說實驗室原來從takara買感受態（competent cell） ， 后來發現還是自己做的效率高（protocol免費索?。?。要注意的是LB必須無菌而且沒有抗生素 ， 實驗室原來有個技術員 ， 做一次失敗一次 ， 我就奇怪了 ， 后來才發現他用的居然是加了kana的LB ， 直接暈過去了 。
7. 鑒定
想要快速鑒定 ， 建議用菌液PCR ， 菌液PCR是有一定講究的 ， 很多人做菌液PCR鑒定假陽性特多 ， 為什么？因為你PCR引物選的都在載體上 ， 注意引物必須分別在載體和插入片段上才準 ， PCR方法鑒定是極其準確的 ， 數百次菌液PCR經驗 。PCR鑒定做起來也很簡單 ， 拿個2mL tube ， 裝0.5mL 加入相應抗生素的LB ， 搖個三小時左后取1uL做模板就行了 。如果想更快 ， 直接菌落PCR也不錯 ， 效果一樣 。
8. 測序
拿到測序結果時 ， 不僅要核對序列 ， 還要看測序峰圖 ， 這很重要 。因為有時候光看序列對 ， 實際上圖顯示的不對 ， 或者雖然序列結果不對 ， 但是圖上出現的峰值本身就很怪異不可信 ， 出現突變也不怕 ， 有很大可能性是簡并密碼子；
還要重點檢查的地方就是“接頭”的地方 ， 因為偶爾引物會出錯 ， 比方說少個堿基什么的 ， 還有時候酶切之后連接也會丟一兩個堿基什么的 ， 如果不仔細檢查到了后期悔之無及 。