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引物二聚體

生活百科

在做primer design的時候 ， 怎么判斷引物有沒有形成發夾結構？在design時 ， 不能形成引（1）看引物序列里有無回文序列 。
（2）不是的 ， 引物二聚體的產生原因比較多 ， 其中很重要的一個就是引物自身的原因 ， 也就是設計的引物特異性不好 ， 不能有效的和模板進行結合 ， 而出現引物自身配對結合的情況導致二聚提的出現；其次還可能是PCR體系及反應條件的問題 ， 如果PCR體系中引物、鎂離子以及酶濃度過高等 ， 都容易產生二聚體 ， 這時要適當降低濃度 ， 比如20uLPCR體系中 ， 一般10pmol/ul的引物 ， 加0.2ul就可以了；還有可能是退火溫度的問題 ， 可以做個梯度PCR或降落PCR ， 來摸索一個合適的退火溫度 ， 也可有效地減少二聚提的出現 。

引物設計可以使用Primer Premier 5.0 ， 操作比較簡便 ， 同時它可以自動分析引物是否有發夾結構、引物二聚體等 ， 非常方便 。

如何檢測自己設計的兩條引物是否會形成二聚體一般的引物設計軟件里都會有dimer的檢測呀

PCR的引物二聚體怎么判斷這個不好說：一般引物二聚體小于150BP.條帶模糊、條帶寬、跑的比較快在溴酚藍前面.你可以跑膠過程總觀察一下 。如果不是可能為非特異性擴增 。您片段要是比較短建議您克隆后測序效果比較好.

熒光定量pcr怎么判斷引物二聚體如果是Sybre Green做的 ， 溶解曲線和特異性的產物不一樣 ， 二聚體的溶解曲線溫度低 ， 峰也很寬 。
如果是探針做的 ， 就不會有信號 。

如何判斷兩個離子是否等電子1.陰極上是陽離子放電：
依照的是金屬活動順序表排在越前的金屬離子越難放電
Ag＋＞Hg2+＞Cu2＋＞（H＋）＞Pb2+＞Sn2＋＞Fe2+＞Zn2+＞Al3＋＞Mg2+＞Na＋
離子氧化性越強越先放電
2.陽極上是陰離子放電
S2－＞I－＞Br－＞Cl－＞OH－＞SO42－＞NO3－＞F－
陰離子還原性越強越先放電
3.特殊情況：若接電源正極的陽極材料為活潑金屬（即H）
的話 ， 則金屬本身放電 ， 輪不到陰離子

做實時定量PCR時 ， 如果有引物二聚體 ， 對實驗結果有什么影響嗎？影響不大 。探針法沒影響 ， 染料摻入法 ， 現在的儀器都自動刷掉那些長度太小的擴增信號 。
有人說可能對溶解曲線產生影響 ， 不過我做染料摻入法做的少 ， 沒試過 。
當然在設計引物時避免引物形成自身二聚體或互相二聚體是最好的 ， 實在是形成了也沒關系 ， 上機跑一次唄 ， 一小時的事 。

做實時定量PCR時 ， 如果有引物二聚體 ， 對實驗結果有什么影響嗎【引物二聚體】熒光定量PCR是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針 ， 對PCR產物進行標記跟蹤 ， 實時在線監控反應過程 ， 結合相應的軟件可以對產物進行分析 ， 計算待測樣品模板的初始濃度 。|||原理不同：熒光定量pcr實時監測與dna結合的熒光染料激發的熒光；普通pcr通過檢測插入dna中核算染料的量來測定pcr最終產物量 ， 一般是紫外光 。反應要求：熒光定量對擴增片段有較高的要求 ， 一般為100-300bp；普通定量可以擴增長點的片段 。如果不需要檢測產物分子量大小 ， 熒光定量可以不進行電泳就對產物進行定量分析 ， 普通pcr必須電泳 。結果：熒光定量可以實現精確定量 ， 普通pcr則不行 。熒光定量體現可以看到整個擴增過程 ， 可以看到擴增效率 ， 溶解溫度 ， 直接得到的標準曲線等 ， 這些是普通pcr無法實現的 。|||這個還真不大清楚|||貌似前者是定量 ， 后者屬于半定量 。|||簡單的講PCR技術最早是用于擴增一段特異的PCR片段 ， 用于克隆、測序等實驗 ， 后來也將其用于樣本中特異的PCR片段有無或非很粗的相對定量 ， 而熒光定量PCR技術則是為了測定樣本中特異的PCR片段相對及絕對量 ， 是一種測定特異的PCR片段含量的方式 。如測定病人樣本中病原體的含量、實驗樣本中某一特定的mRNA的含量等 。前些年有人講過普通PCR后 ， 通過電泳也可以進行定量 ， 其實是將PCR產物的定量與PCR樣本中模板定量相混了 。近兩年沒有人再講這類的話了 。|||引物設計是sybr定量PCR法的最大難點 ， 機會好的話 ， 設計一對引物就能得到很好的結果 ， 機會不好的話7、8對引物也出不來 ， 我就遇到過這樣的問題 ， 我在prime5.0上設計了8對引物 ， 符合實驗要求的一對也沒有 ， 我把退火溫度提高到了68度也沒能把引物二聚體搞定 ， 后來我想通了 ， 可能我這對引物把其它序列擴增出來了 ， 而且擴增效率很高（我一個同學設計了十幾對才找到一對好用的） 。記住primer5.0設計出來的100%好的引物 ， 到了定量PCR上不一定好使 ， 這是我最大的經驗 。定量pCR的引物對匹配度要求不高 ， 我現在使用的引物就有幾個堿基不匹配 ， 但實驗結果很好 。有一個辦法可以幫助我們繞過引物設計這道坎 ， 直接到羅氏網站上專區上找引物 。羅氏網站在線有一個引物設計軟件 ， 你只要找好你目的基因的種屬 ， 輸入你的片段序列就可以得到你要的引物 。這個軟件有很大的好處 ， 他會自動地把你的種屬序列背景扣除 ， 最大限度地去除引物二聚體產生的可以 。

引物是如何影響PCR反應的引物是PCR反應中非常重要的一環 ， 我認為引物對PCR的影響主要體現在2方面：
1 ， 影響PCR的特異性 ， 也就是說 ， 所擴增的片段能否是你想要的特異性目的片段 ， 而不是非特異性雜帶 ， 一般來說 ， 引物與模板序列匹配的越多 ， 其特異性越好 ， 但引物并不是越長越好 ， 其原因就是下一個方面；
2 ， 影響PCR的效率 ， 在退火環節中 ， 引物越長 ， 退火的反應就越慢 ， 過長時就會阻礙PCR反應的順利進行 ， 而引物短 ， 則能更快的使引物與模板結合 ， 但其特異性就下降 ， 有可能會出現“亂搭”的情況；
除此之外 ， 引物的GC含量以及引物二聚體的存在 ， 也會影響PCR反應 ， 但我認為主要的還是上述2方面（因為如果不考慮酶切位點的情況 ， 往往目的片段已定時 ， 引物序列能調整的主要就是其長度） ， 所以需要根據模板的情況和目的片段特點 ， 選擇合適長度和起始的引物 ， 對PCR的順利進行是很有幫助的 。
如有疑問 ， 歡迎繼續討論 ， 純屬手打 ， 歡迎采納 ， 祝愉快！

在做PCR時 ， 出現引物二聚體一.引物設計和樣品使用均是一樣的情況 ， 就是反應條件的問題
二.反應條件就看你的實驗操作和所使用的儀器 ， 操作都一樣的話 ， 儀器設定上出問題的可能性會大一些 ， 其中退貨溫度是比較關鍵的
三.人品問題也會導致這樣的情況
四.一般減少引物二聚體的方法：
1.
從引物自身著手 ， 重新設計引物 ， 這是最根本解決這一問題的辦法；
2.
可能模板有問題；
3.
模板濃度過小 ， 適當加大模板量；
4.
Taq酶 ， 引物 ， Mg2+濃度可能過高 ， 可降低它們的濃度；
5.
取你所要加的上下游引物混合后 ， 在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘 ， 然后迅速拿出至于冰塊之上瞬時冷卻 ， 這時再加入反應體系當中 ， 引物二聚體就會消失的；
6.
所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO ， 可以增強特異性；
7.
PCR反應體系的配制在冰上進行 ， 最后加TAq酶 ， PCR結束后 ， 產物勿放置在室溫下過長時間 ， 有人認為室溫下有些TAQ酶會將多余的引物合成為二聚體；
8.
增加循環數；
9.
降低退火溫度后有條帶 ， 則應逐漸提高溫度 ， 若提高溫度的同時產物量減少 ， 則考慮增加鎂離子濃度（根據擴增片斷長度而定 ， 片段長則相應鎂離子濃度應該高一些）；
10.
若降低退火溫度 ， 發現還是只有引物二聚體 ， 而且鎂離子的濃度在
20-25mmol/l沒有區別 ， 則考慮Buffer等試劑沒有完全融解、混勻 ， 導致吸取的試劑濃度不對；
11.
以上次的PCR產物作模板二次PCR ， 可以提高引物與模板的特異性 ， 減少引物二聚體 ， 如果兩次時間間隔短的話 ， 可以把原產物稀釋100－1000倍 ， 如果間隔較長可以稀釋50－100倍 。

PCR目的DNA片段較淺,引物二聚體很亮是什么原因如果沒有雜帶 ， 只是目的條帶不亮 ， 就不是特異性問題 ， 而是擴增效率較低 ?？赡苁且锝Y合不好 ， 或者兩個引物退火溫度差異過大等原因 ?？梢韵仍囈辉嚱档屯嘶饻囟?nbsp;， 增加循環數 。提高模板濃度 ， 或回收后再次擴增也可以試一試 。如果要求不是很高 ， 這樣優化一下就差不多了 。

進行PCR擴增時為什么將cDNA模板稀釋以后就出現引物二聚體了？根本原因應該是RNA純度不夠 ， 導致反轉錄的cDNA濃度低 。稀釋之后DNA與引物結合的機會少了 ， 引物自己結合成二聚體.
多種原因要逐一排除：
1.先用內參基因檢測一下如
β-actin ， GAPDH ， 18s-rRNA這類基因是生物體或者細胞中穩定表達的基因 ， 表達量幾乎不變 ， 如果有條帶證明反轉錄沒問題 。
2.內參檢測時候最好讓別人代為操作 ， 可以排除人為操原因
3.跑PCR時候可以加一個內參做陽性對照 ， 保證CDNA質量（反復凍融會影響CDNA質量）
4.適當降低退火溫度2~4℃
5.上述都排除之后就是引物問題了 。
PCR試劑除了taq酶要放在-20℃ ， 其他的都不能反復凍融 。建議分裝出來后長期保存放-20
使用液放4℃
。

PCR產物引物二聚體嚴重 ， 目的片段很淡 ， 怎么解決PCR產物引物二聚體嚴重 ， 目的片段很淡 ， 怎么解決
只要目的片段位置正確 無需去管引物及其二聚體的,結果可靠.
究竟是不是引物二聚體 你從理論上就可以分析判斷.
一般常見情況是引物加過量了,在溴酚藍位置常見亮帶,在這中情況下,你不需要理他,若需要漂亮圖片（發論文）,2辦法：可以減少引物加入量,同時稍微降低鎂離子濃度；或者在保證底物不缺乏情況下,增加幾個循環 就可以消除引物帶.

生物學教育屬于理工類專業嗎?也就是師范類生物專業 ， 大學的理化生地理都是理科

華東理工大學生物學科好不好相當不錯的 ，  ，  ， 首先華東理工作為全國知名的理工學校 ，  ，  ， 里面的理科類專業更不用說了 。。文科的話那就不行了

大連理工大學生物學這個專業怎么樣？免了吧 ， 大工生物不太好 ， 植物也不太好 。而且生物環境學院老師的口碑很不好 。舉個例子 ， 學校規定給學生的補助 ， 老師1/4先到位后 ， 學校再發那3/4 ， 這位老師的方法是：先把那1/4發給你 ， 等學校的補助到位后 ， 再把它都要回來 。
所以 ， 免了吧 。

浙江理工大學生物學考研復試專業英語考啥 ， 給你英語文獻 ， 讓你讀和翻譯 。

香港理工大學應用生物兼生物科技 好嗎應用生物兼生物科技是一門交叉學科 ， 不歸屬于醫學類專業 ， 而是一門工科的專業 。它是綜合了生物學、醫學和工程學的理論而發展起來 ， 由于是多學科的有機融合 ， 它與生物學、醫學這些傳統的經典學科又有所不同 ， 也有別于純粹的工程學科 。
應用生物兼生物科技主要通過生物學、工程學及醫學方面的理論和基礎對人體系統變化進行研究 。最重要的是運用一些醫學技術來控制解決疾病 ， 主要目的是解決醫學中的所有難題 ， 保障人們的健康 。希望我的回答可以幫助到你 ， 望采納！

pcr如果只有引物二聚體時應該怎樣調整首先檢查模板有沒問題,然后降低PCR退火溫度試試,降低退火溫度可增加引物的結合量,但也增加了錯配可能.也可以換種PCR Mix.還不行的話換對引物二聚體少的引物.

如何判斷兩個引物是否形成二聚體PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內 ， 有些最好于當日電泳檢測 ， 大于48h后帶型不規則甚致消失 。假陰性 ， 不出現擴增條帶PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備 ， ②引物的質量與特異性 ， ③酶的質量及 ，  ④PCR循環條件 。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究 。模板：①模板中含有雜蛋白質 ， ②模板中含有Taq酶抑制劑 ， ③模板中蛋白質沒有消 化除凈 ， 特別是染色體中的組蛋白 ， ④在提取制備模板時丟失過多 ， 或吸入酚 。⑤模 板核酸變性不徹底 。在酶和引物質量好時 ， 不出現擴增帶 ， 極有可能是標本的消化處 理 ， 模板核酸提取過程出了毛病 ， 因而要配制有效而穩定的消化處理液 ， 其程序亦應 固定不宜隨意更改 。酶失活：需更換新酶 ， 或新舊兩種酶同時使用 ， 以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性 。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠 。引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱 ， 是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因 。有些批號的引物合成質量有問題 ， 兩條引物一條濃度 高 ， 一條濃度低 ， 造成低效率的不對稱擴增 ， 對策為：①選定一個好的引物合成單 位 。②引物的濃度不僅要看OD值 ， 更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳 ， 一定要有引物條帶出現 ， 而且兩引物帶的亮度應大體一致 ， 如一條引物有條帶 ， 一條引物無條帶 ， 此時做PCR有可能失敗 ， 應和引物合成單位協商解決 。如一條引物亮度高 ， 一條亮度低 ， 在稀釋引物時要平衡其濃度 。③引物應高濃度小量分裝保存 ， 防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分 ， 導致引物變質降解失效 。④引物設計不合理 ， 如引物長度不夠 ， 引物之間形成二聚體等 。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大 ， 濃度過高可降低PCR擴增的特 異性 ， 濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶 。反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul ?；?00ul ， 應用多 大體積進行PCR擴增 ， 是根據科研和臨床檢測不同目的而設定 ， 在做小體積如20ul 后 ， 再做大體積時 ， 一定要模索條件 ， 否則容易失敗 。物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要 ， 如變性溫度低 ， 變性時間短 ， 極有可能出現假陰性;退火溫度過低 ， 可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率 。有時還有必要用標準的溫度計 ， 檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度 ， 這也是PCR失敗的原因之一 。靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失 ， 影響引物與模板特異性結合 ， 或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列 ， 其PCR擴增是不會成功的 。假陽性出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致 ， 有時其條帶更整齊 ， 亮度更高 。引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性 ， 因而在進行PCR擴增時 ， 擴增出的PCR產物為非目的性的序列 。靶序列太短或引物太短 ， 容易出現假陽性 。需重新設計引物 。靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染 ， 導致假陽性 。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔 ， 防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外 。除酶及不能耐高溫的物質外 ， 所有試劑或器材均應高壓消毒 。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用 。必要時 ， 在加標本前 ， 反應管和試劑用紫外線照射 ， 以破壞存在的核酸 。二是空氣中的小片段核酸污染 ， 這些小片段比靶序列短 ， 但有一定的同源性 ?？苫ハ嗥唇?nbsp;， 與引物互補后 ， 可擴增出PCR產物 ， 而導致假陽性的產生 ， 可用巢式PCR方法來減輕或消除 。出現非特異性擴增帶PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致 ， 或大或小 ， 或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶 。非特異性條帶的出現 ， 其原因：一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體 。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低 ， 及PCR循環次數 過多有關 。其次是酶的質和量 ， 往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶 則不出現 ， 酶量過多有時也會出現非特異性擴增 。其對策有：必要時重新設計引 物 。減低酶量或調換另一來源的酶 。降低引物量 ， 適當增加模板量 ， 減少循環次 數 。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性 ， 65℃左右退火與延伸) 。出現片狀拖帶或涂抹帶PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶 。其原因往往由于酶量過多或酶的質量 差 ， dNTP濃度過高 ， Mg2+濃度過高 ， 退火溫度過低 ， 循環次數過多引起 。其對策有：減少酶量 ， 或調換另一來源的酶 。②減少dNTP的濃度 。適當降低Mg2+濃 度 。增加模板量 ， 減少循環次數 ?？寺CR產物1)克隆PCR產物的最優條件是什么？最佳插入片段：載體比需實驗確定 。1：1（插入片段：載體）常為最佳比 ， 摩爾數比1：8或8：1也行 。應測定比值范圍 。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶 ， 插入片段共10ul 。室溫保溫1小時 ， 或4℃過夜 。在這2種溫度下 ， 缺T-凸出端的載體會自連 ， 產生藍斑 。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求 ， 為提高連接效率 ， 需4℃過夜 。2)PCR產物是否需要用凝膠純化？如凝膠分析擴增產物只有一條帶 ， 不需要用凝膠純化 。如可見其他雜帶 ， 可能是積累了大量引物的二聚體 。少量的引物二聚體的摩爾數也很高 ， 這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆 ， 而非目的插入片段 。為此需在克隆前做凝膠純化 。3)如果沒有回收到目的片段 ， 還需要作什么對照實驗？A）涂布未轉化的感受態細胞 。如有菌落 ， 表明氨芐失效 ， 或污染上帶有氨芐抗型的質粒 ， 或產生氨芐抗型的菌落 。B）轉化完整質粒 ， 計算菌落生長數 ， 測定轉化效率 。例如 ， 將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態細胞轉化 。用SOC稀釋到1000ul后 ， 用100ul鋪板 。培養過夜 ， 產生1000個菌落 。轉化率為： 產生菌落的總數/鋪板DNA的總量 。鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數 。具體而言轉化用10ng DNA ， 用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA ， 用1/10鋪板 ， 共用1 ng DNA 。轉化率為：1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態細胞如沒有菌落或少有菌落 ， 感受態細胞的轉化率太低 。C）如用pGEM-T正對照 ， 或PCR產物 ， 產生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態細胞） ， 表明載體失去T ?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶 。T4 DNA連接酶（M1801 ， M1804 ， M1794）質量標準好無核酸酶污染 ， 不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換 。D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體 ， 連接pGEM-T正對照 ， 轉化高頻率感受態細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟 ， 可得100個菌落 ， 其中60%應為白斑 ， 如產生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落 ， 連接有問題 。4)對照實驗結果好 ， 卻沒有回收到目的片段 ， 實驗出了什么問題？A）連接用室溫保溫1小時 ， 能滿足大多數克隆 ， 為提高效率 ， 需4℃過夜 。B）插入片段帶有污染 ， 使3`-T缺失 ， 或抑制連接 ， 抑制轉化 。為此 ， 將插入片段和pGEM-T正對照混合 ， 再連接 。如降低了對照的菌落數 ， 插入片段需純化 ， 或重新制備 。如產生大量的藍斑 ， 插入片段污染有核酸酶 ， 使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失 。C）插入片段不適于連接 。用凝膠純化的插入片段 ， 因受UV過度照射 ， 時有發生 。UV過度照射會產生嘧啶二聚體 ， 不利于連接 ， DNA必需重新純化 。D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A ， 后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需 。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A 。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042） 。E）高度重復序列可能會不穩定 ， 在擴增中產生缺失和重排 ， 如發現插入片段高頻率地產生缺失和重排 ， 需用重組缺陷大腸桿菌菌株 ， 如SURE細胞PCR反應體系與反應條件標準的PCR反應體系：10×擴增緩沖液10ul4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaq DNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水至100ulPCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵 ， PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度 。理論上 ， 只要知道任何一段模板DNA序列 ，  就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物 ， 利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增 。設計引物應遵循以下原則：①引物長度： 15-30bp ， 常用為20bp左右 。②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜 ， 特定條件下可擴增長至10kb的片段 。③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜 ， G+C太少擴增效果不佳 ， G+C過多易出現非特異條帶 。ATGC最好隨機分布 ， 避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 。④避免引物內部出現二級結構 ， 避免兩條引物間互補 ， 特別是3'端的互補 ， 否則會形成引物二聚體 ， 產生非特異的擴增條帶 。⑤引物3'端的堿基 ， 特別是最末及倒數第二個堿基 ， 應嚴格要求配對 ， 以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗 。⑥引物中有或能加上合適的酶切位點 ，  被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點 ，  這對酶切分析或分子克隆很有好處 。⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性 。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol ， 以最低引物量產生所需要的結果為好 ， 引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增 ， 且可增加引物之間形成二聚體的機會 。酶及其濃度　目前有兩種Taq DNA聚合酶供應 ，  一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶 ， 另一種為大腸菌合成的基因工程酶 。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時) ， 濃度過高可引起非特異性擴增 ， 濃度過低則合成產物量減少 。dNTP的質量與濃度　dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系 ， dNTP粉呈顆粒狀 ， 如保存不當易變性失去生物學活性 。dNTP溶液呈酸性 ， 使用時應配成高濃度后 ， 以1M NaOH或1M Tris 。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5 ， 小量分裝 ，  -20℃冰凍保存 。多次凍融會使dNTP降解 。在PCR反應中 ， dNTP應為50～200umol/L ， 尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制) ， 如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低) ， 就會引起錯配 。濃度過低又會降低PCR產物的產量 。dNTP能與Mg2+結合 ， 使游離的Mg2+濃度降低 。模板(靶基因)核酸　模板核酸的量與純化程度 ， 是PCR成敗與否的關鍵環節之一 ， 傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本 。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質 ， 因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜 ， 并解離細胞中的核蛋白 ， SDS 還能與蛋白質結合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質 ， 特別是與DNA結合的組蛋白 ， 再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份 ， 用乙醇或異丙醇沉淀核酸 。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應 。一般臨床檢測標本 ， 可采用快速簡便的方法溶解細胞 ， 裂解病原體 ， 消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離 ， 直接用于PCR擴增 。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法 ， 要防止RNase降解RNA 。Mg2+濃度　Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響 ， 在一般的PCR反應中 ， 各種dNTP濃度為200umol/L時 ， Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜 。Mg2+濃度過高 ， 反應特異性降低 ， 出現非特異擴增 ， 濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性 ， 使反應產物減少 。PCR反應條件的選擇PCR反應條件為溫度、時間和循環次數 。溫度與時間的設置： 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點 。在標準反應中采用三溫度點法 ， 雙鏈DNA在90～95℃變性 ， 再迅速冷卻至40 ～60℃ ， 引物退火并結合到靶序列上 ， 然后快速升溫至70～75℃ ， 在Taq DNA 聚合酶的作用下 ， 使引物鏈沿模板延伸 。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法 ，  除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一 ， 一般采用94℃變性 ， 65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性) 。①變性溫度與時間：變性溫度低 ， 解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因 。一般情況下 ， 93℃～94℃min足以使模板DNA變性 ， 若低于93℃則需延長時間 ， 但溫度不能過高 ， 因為高溫環境對酶的活性有影響 。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性 ， 就會導致PCR失敗 。②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素 。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃ ， 可使引物和模板發生結合 。由于模板DNA 比引物復雜得多 ， 引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞 。退火溫度與時間 ， 取決于引物的長度、堿基組成及其濃度 ， 還有靶基序列的長度 。對于20個核苷酸 ， G+C含量約50%的引物 ， 55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想 。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)復性溫度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允許范圍內 ，  選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合 ，  提高PCR反應的特異性 。復性時間一般為30～60sec ， 足以使引物與模板之間完全結合 。③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子70℃ 60核苷酸/S/酶分子55℃ 24核苷酸/S/酶分子高于90℃時 ，  DNA合成幾乎不能進行 。PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間 ， 常用溫度為72℃ ， 過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合 。PCR延伸反應的時間 ， 可根據待擴增片段的長度而定 ， 一般1Kb以內的DNA片段 ， 延伸時間1min是足夠 的 。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min 。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現 。對低濃度模板的擴增 ， 延伸時間要稍長些 。

判斷是pcr產物還是引物二聚體加一個marker ， 比較一下長度 ?；蛘咦鲆粋€對照 ， 只加引物不加模板 ， 若電泳有條帶 ， 就是引物二聚體 ， 建議重新設計引物 。

pcr 擴增產生大量引物二聚體的原因引物3'端末端有互補序列 ， 這樣造成引物以引物為模板進行延伸 ， 造成引物二聚體 。

在做PCR時 ， 出現引物二聚體一.引物設計和樣品使用均是一樣的情況 ， 就是反應條件的問題二.反應條件就看你的實驗操作和所使用的儀器 ， 操作都一樣的話 ， 儀器設定上出問題的可能性會大一些 ， 其中退貨溫度是比較關鍵的三.人品問題也會導致這樣的情況四.一般減少引物二聚體的方法： 1. 從引物自身著手 ， 重新設計引物 ， 這是最根本解決這一問題的辦法；2. 可能模板有問題；3. 模板濃度過小 ， 適當加大模板量；4. Taq酶 ， 引物 ， Mg2+濃度可能過高 ， 可降低它們的濃度；5. 取你所要加的上下游引物混合后 ， 在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘 ， 然后迅速拿出至于冰塊之上瞬時冷卻 ， 這時再加入反應體系當中 ， 引物二聚體就會消失的；6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO ， 可以增強特異性； 7. PCR反應體系的配制在冰上進行 ， 最后加TAq酶 ， PCR結束后 ， 產物勿放置在室溫下過長時間 ， 有人認為室溫下有些TAQ酶會將多余的引物合成為二聚體； 8. 增加循環數；9. 降低退火溫度后有條帶 ， 則應逐漸提高溫度 ， 若提高溫度的同時產物量減少 ， 則考慮增加鎂離子濃度（根據擴增片斷長度而定 ， 片段長則相應鎂離子濃度應該高一些）；10. 若降低退火溫度 ， 發現還是只有引物二聚體 ， 而且鎂離子的濃度在 20-25mmol/l沒有區別 ， 則考慮Buffer等試劑沒有完全融解、混勻 ， 導致吸取的試劑濃度不對；11. 以上次的PCR產物作模板二次PCR ， 可以提高引物與模板的特異性 ， 減少引物二聚體 ， 如果兩次時間間隔短的話 ， 可以把原產物稀釋100－1000倍 ， 如果間隔較長可以稀釋50－100倍 。

什么是引物二聚體？pcr反應中 ， 兩條引物上的互補堿基相結合形成的聚合體 ， 最好能避免 。

有條帶 ， 有引物二聚體 ， 是增加tm值嗎有誰會等誰一輩子
愛情沒有誰會等一輩子,別失去才后悔……
如果你在一生里遇見了你心愛的人,可以說你是幸運的,無論結局怎樣,都可以說是幸福的吧?白頭到老,固然很好,如果分手了,或者為愛情而傷心,也都是很幸福,畢竟你愛過,你為了愛情在落淚,為了愛情在心碎,曾經很浪漫過,兩個人可以在冬天的風下瘋狂,在夏天的雨下漫步,即使當初的戀人已經遠去但戀愛時的浪漫情節依然在你的心里埋藏,這不也是一件很快樂的事情嗎?
記得一本書中說過,一

如何確定引物二聚體和擴增產物的Tm值？最近在做qPCR ， 今天遇到個樣品的濃度很低 ， 想看看能不能做出樣品10倍梯度稀釋的曲線 ， 于是照常做了 。結果最后的溶解曲線發現 ， 頭三個的Tm是84 ， 之后的5個樣品時77 。從Ct值來看 ， 也是頭三個還有點像樣 ， 后面的Ct都是33-34.很顯然后面的5個應該不是擴增產物 ， 應該是奈不住寂寞的引物二聚體之類的非目的產物 。還是補個圖吧 ， 意思一下就是啦 。這只是一時手癢做的 ， 不是很好啦 。舉報刪除此信息

這是引物二聚體嗎？引物二聚體跑的最快 ， 速度超過了loading buffer指示劑 。二聚體條帶彌散 ， 若你的目的片段和此片段有差距 ， 基本可斷定此為二聚體