臺盼藍染色活細胞臺盼藍染色活細胞顏色 _知識經驗

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1、一. 臺盼藍配制：4％臺盼藍母液：稱取4克臺盼藍，加入少量蒸餾水研磨，加0.9%NaCl至100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。
2、或者直接用0.9%的生理鹽水或者PBS配成母液用的時候用生理鹽水或者PBS稀釋。
3、臺盼藍染色步驟：1.、4%臺盼藍母液：稱取4g臺盼藍，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100ml ，用濾紙過濾，4度保存。
4、使用時。
5、用PBS稀釋至0.4% 。
6、（也可買Gibco的成品）; T2、胰酶消化貼壁細胞，制備單細胞懸液，并作適當稀釋。
7、3、染色：細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9:1混合混勻。
8、（終濃度0.04%）4、計數：在三分鐘內，分別計數活細胞和死細胞。
9、5、鏡下觀察，死細胞被染成明顯的藍色，而活細胞拒染呈無色透明狀。
10、6、統計細胞活力：活細胞率（%）= 活細胞總數/（活細胞總數+死細胞總數）×100%二. 結晶紫配制：結晶紫2.0g草酸銨0.8g95％酒精 20ml餾水80ml先將結晶紫溶于酒精，草酸銨溶于蒸餾水中，然后將兩液混合，靜置48小時使用。
11、此染液穩定，置密閉的棕色瓶中可儲存數月。
12、結晶紫染色步驟：1．在96孔細胞培養板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 WEHI-164細胞的培養液（含10％小牛血清的RPMI-1640培養液），37℃ 5％ CO2的二氧化碳培養箱中培養2～3小時，讓細胞帖壁。
13、2．用RPMI-1640培養液10倍遞次稀釋TNF標準品，根據需要3～5倍遞次稀釋待檢樣品，每孔加0.1ml稀釋的標準品或待檢樣品，每個稀釋度3個重復孔。
14、對照孔6個，3個陽性對照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培養液，3個陰性對照孔各加100μl RPMI-1640培養液。
15、繼續培養18～24小時。
16、3．甩去培養液，用PBS小心洗滌一次，每孔加0.1ml 10％甲醇溶液固定細胞30秒鐘。
17、4．吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml結晶紫染液，室溫中放置20分鐘。
18、5．輕輕甩去染色液，用蒸餾水洗滌各孔，將培養板倒置于吸水紙上吸干水分。
19、自然干燥或37℃烘干。
20、此板可以在室溫中長期保存。
21、6．測定前，每孔加0.1ml 33％醋酸脫色，充分振蕩后在570nm處測定光吸收度。
22、用光吸收度（OD）值對樣品稀釋度作圖，比較標準品曲線和待檢樣品曲線即可得到待測樣品中的細胞因子活性。
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