以下文章來源于中科院高能所 顯微鏡是誰發明的，作者小溪 。

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導讀突然襲來的新冠肺炎疫情，讓人類又一次見識了病毒的威力 。肉眼看不到的病毒作為一類物種，很可能從地球生命誕生之初就已經存在，而人類從意識到有病毒存在，再到看到病毒的模樣，直至最后弄清病毒的內部結構成分，經歷了漫長的過程 。

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病毒在19世紀末就已被證實肯定存在，但因“阿貝極限”使光學顯微鏡無法達到更高的分辨率，始終看不到病毒的蹤影，直至近年來這個難題被科學家解決 。

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撰文 | 小 溪

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20世紀30年代，電子顯微鏡的發明使神秘的病毒終于現出了真身，只是電子顯微鏡的原理決定了它無法用于活細胞的觀察及獲取生物活動的動態信息，而攻克致病病毒，需要深入了解病毒在活細胞內感染、復制及釋放的動態過程 。

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科學界期待著能有可獲取生物過程動態信息的、更高分辨率的光學顯微鏡 。光學顯微鏡的“阿貝極限”究竟有沒有可能被突破呢？

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盡管每項科學技術的發展都會歷盡艱辛，只是沒想到，真正突破“阿貝極限”竟用了百余年，在此期間數項新技術的發明起到了極為關鍵的作用！

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01 相襯

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“相襯”是顯微技術中的一個重大進步 。

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光學顯微鏡觀察細胞時一般都需要染色，這是因為細胞結構中大部分組分都是透明的 。透明度高的物體也稱為位相物體，光波通過位相物體時不改變振幅 (光的強弱) 只改變位相，但人眼只能辨別出振幅的變化，因此在光學顯微鏡下難以區分不同的細胞組分 。

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【顯微鏡是誰發明的:從新冠病毒回顧光學顯微鏡發展歷程：這個難題百年后才有突破】

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用有機染料對不同的細胞組分進行選擇性染色后，可借助不同的顏色反襯來提高細胞不同組分圖像的對比度，便于更清楚地進行觀察和研究 。但染色是一個非常困難和耗時的過程，常常會對觀察的生物樣本產生傷害，甚至殺死細胞 。

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波的位相示意圖

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有沒有辦法讓光學顯微鏡的生物樣本可以不經染色而直接清楚地觀察到活細胞的內部結構呢？

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20世紀30年代初，荷蘭的弗里茨·澤尼克 (Frits Zernike) 在實驗中偶然發現：不可見的光相位變化可以轉變為可見的振幅變化，他根據位相理論研究出了位相反襯法 (一種光學信息處理方法)，通過某種空間濾波器將位相變化產生的不可見信息轉化為與之等價的可見的振幅信息，改善透明物體成像的反襯度，可大大提高透明物體的可分辨性 。

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弗里茨·澤尼克(Frits Zernike)

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澤尼克利用光的干涉原理，在傳統的光學顯微鏡中加入相位板 (將位相差轉換成振幅差) 研制出相襯顯微鏡 (Phase Contrast Microscope，簡稱PCM) 的原型機并申請了專利，可惜當時他的發明沒有受到重視 。

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第二次世界大戰的爆發影響了澤尼克的研究，但他以百折不撓的精神不斷改進技術 。1941年，第一臺實用的相襯顯微鏡終于在蔡司公司誕生 。當時的顯微鏡觀察細胞時都需要染色 (染色會殺死細胞)，而相襯顯微鏡則可直接觀察到活細胞的內部結構 。

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目前，大部分高級光學顯微鏡及電子顯微鏡中都配置了相襯部件 。相襯顯微鏡在細菌學、病理學等方面應用廣泛，生物學研究因此有了極大突破(澤尼克因論證相襯法及發明相襯顯微鏡的貢獻獲1953年諾貝爾物理學獎) 。

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早期的相襯顯微鏡
下排是透明樣品加上相襯技術后的顯微圖像
02 熒光
熒光的發現為后來超分辨率光學顯微鏡的研制打下了基礎 。
早在1845年，英國皇家學會的約翰·赫歇爾 (John Herschel) 在一份報告中描述了他觀察到的一種現象：加了硫酸奎寧 (一種藥物) 的蘇打水在太陽光照射下會發出天藍色的光 。以后，雖然也有人發現類似的現象，但一直沒人能給出科學的解釋 。
約翰·赫歇爾(John Herschel)
1852年，英國的喬治·斯托克斯 (George Stokes) 在他的巨著《論光的折射率變化 (On the Change of Refrangibility of Light) 》中指出：用分光計觀察太陽光照射奎寧和葉綠素的水溶液時，只有當溶液置于光譜的紫外光區域才會產生所發光的波長比入射光波長要長效果 。
斯托克斯判定：這種現象是由于這些物質吸收光能后重新發射出不同波長的光 (屬光致發光)，并非因光的漫射作用引起，他把這種光稱為熒光 (Fluorescence) 。
1864年他在一次演講中首次提出：熒光可作為一種分析工具，可惜他的建議沒能被很快地應用于光學顯微成像技術 。
喬治·斯托克斯(George Stokes)
過了40多年，德國的奧古斯特·科勒 (August K?hler) 與亨利·西登托普夫 (Henry Siedentopf) 于1911年研制出首個熒光顯微鏡 (Fluorescence Microscope) 測試裝置 。
當時的熒光顯微鏡以紫外光線為光源，用熒光色素對觀測目標 (細菌、植物、動物組織等) 進行染色處理，紫外光的照射會激發觀測目標上的熒光物質發出熒光，研究者根據自發熒光的成像開展研究 。
熒光顯微鏡可用于觀察細菌、植物和動物組織中的自發熒光現象 。但因植物和動物組織中的自發熒光很弱，加之當時相關的技術還不夠成熟，熒光顯微鏡的應用在20世紀初期發展較慢 。
奧古斯特·科勒(August K?hler)、亨利·西登托普夫(Henry Siedentopf)
第一臺熒光顯微鏡測試裝置
20世紀30年代后，得益于各相關科學領域技術的進步和創新，熒光顯微成像技術迎來了新的發展機遇 。
1935年，奧地利的馬克斯·海廷格 (Max Haitinger) 等人改進了生物組織標本的染色技術，用熒光色素染色來標記不能自發熒光的特定組織成分、細菌和其它病原體，標本的熒光亮度增強了，在熒光顯微鏡下可觀察到生物組織的續發性熒光 。20世紀50年代，隨著熒光抗體標記方法及熒光顯微鏡裝置的改進，熒光技術的應用逐漸推廣 。
日本的下村修 (Osamu Shimomura) 等人1962年從維多利亞水母中發現了一種奇特的蛋白質，從藍光到紫外線都能使其受激發而發出綠色熒光 。1974年，他們得到了這種蛋白的純化物，稱為綠色熒光蛋白 (Green Fluorescent Protein，簡稱GFP)。綠色熒光蛋白的最突出特點是光毒性比傳統的熒光分子弱得多，非常適合用于對活細胞進行標記 。而基于綠色熒光蛋白的光學成像技術可使觀察者直接看到從微觀到宏觀各個層次的生命現象 。
下村修(Osamu Shimomura)
在發現綠色熒光蛋白20多年后，美國的馬丁·查爾菲 (Martin Chalfie) 于1993年通過基因重組技術使除水母以外的生物 (大腸桿菌等) 也產生出綠色熒光蛋白 。他將綠色熒光蛋白真正應用于生物樣品的標記，建立起用綠色熒光蛋白研究基因表達的基本方法 。由于許多重大疾病都與基因表達異常相關，查爾菲的成果意義重大 。
美籍華人錢永健 (Roger Y. Tsien) 大幅度改造優化了綠色熒光蛋白，提升了它的發光效率，還進一步發展出紅、藍、黃色的熒光蛋白，在生物學研究領域得到了廣泛應用 。這些熒光蛋白成為生物學家們得心應手的工具，實時監測各類病毒“作案”過程的愿望已可以實現了 。
下村修、查爾菲與錢永健三位科學家因發現、提取和改進綠色熒光蛋白的杰出貢獻獲得了2008年諾貝爾化學獎 。
馬丁·查爾菲(Martin Chalfie)
錢永健(Roger Y. Tsien)
熒光顯微鏡
熒光標記的重組病毒感染模型系統
03 激光
“強光源”也是迫切需要解決的關鍵技術！
阿爾伯特·愛因斯坦 (Albert Einstein) 1916年提出了“關于輻射的量子理論 (On the Quantum Theory of Radiation) ”，其中包括“受激輻射的光放大 (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation，簡稱Laser) ”的概念 (中文譯為激光)，這是如何得到強光源的一個思路，他的論述為后來激光的實現奠定了理論基礎 。
但在自然界普通光源中，產生受激輻射的成分很少，當時的人們并沒認識到該理論的實際應用價值 。
阿爾伯特·愛因斯坦(Albert Einstein)(左)，他1916年發表的論文(右)
基于愛因斯坦的理論，幾十年之后的1953年，美國的查爾斯·唐尼斯 (Charles Townes) 研制成功一臺受激輻射微波放大裝置 。后來該項技術由微波擴展到紅外及可見光范圍 。
1958年，唐尼斯與亞瑟·肖洛(Arthur Schawlow)在《物理評論(Physical Review)》雜志上發表論文，闡述了研制激光器的可能性以及所需的條件，指出這種激光具有亮度極高、單色性好、方向性好的特點 。
就在同一時期，蘇聯的亞歷山大·普羅霍洛夫 (Aleksandr Prokhorov) 及尼古拉·巴索夫 (Nicolay Basov) 也提出了類似的設想 。他們的設想非常吸引人，許多國家竟相開始研制激光器，各種實驗方案都有，只是都未獲得成功 。
這幾位都是了不起的人物，赫赫有名的科學大伽，愛因斯坦就不用說了 。而唐尼斯、普羅霍洛夫及巴索夫三人分享了1964年諾貝爾物理學獎，肖洛則獲得了1981年諾貝爾物理學獎 。
亞瑟·肖洛(Arthur Schawlow)、查爾斯·唐尼斯(Charles Townes)
亞歷山大·普羅霍洛夫(Aleksandr Prokhorov)、尼古拉·巴索夫(Nicolay Basov)
真正研制出第一臺激光器的是美國加利福尼亞州休斯航空公司實驗室的西奧多·梅曼 (Theodore Maiman) 。1960年5月16日，梅曼在自己研制的紅寶石激光器上成功獲得了波長為694.3納米的激光 。7月7日，休斯公司正式宣布了這個消息 。此后，不同工作物質的激光器陸續研制出來，如氦氖氣體激光器、二氧化碳激光器等，激光在各領域的應用研究也迅速展開 。
激光的亮度可比普通光源高20個量級，而且是在包括紅外?可見光?紫外直至X射線波段內的相干輻射光源，意義極為重大，因此被譽為是20世紀繼原子能、計算機、半導體之后的又一重大發明 。梅曼獲得富蘭克林學會、美國物理學會、光學學會等多個獎項，曾兩度被諾貝爾獎提名，可惜未能獲得諾貝爾獎 。
西奧多·梅曼(Theodore Maiman)與他研制的紅寶石激光器
04 共聚焦
激光技術的突破使另一關鍵技術——“共聚焦成像”的構想有了成功的可能 。
共聚焦成像 (Confocal Imaging) ”的構想是美國的馬文·明斯基 (Marvin Minsky)(被稱為“人工智能之父”) 在20世紀50年代提出的 。
其原理是利用逐點掃描照明，并用空間針孔濾波手段去除樣品焦點平面外散射光進行共聚焦成像 。他為此設想申請了專利，也研制出一臺共聚焦掃描顯微鏡的樣機 。
但當時缺乏適用的超強光源，加之數據處理能力也還達不到所需的標準，這個構想實際上只停留在理論階段 。
馬文·明斯基(Marvin Minsky)
明斯基研制的共聚焦掃描顯微鏡樣機
梅曼的激光器研制獲得成功之后，美國的保羅·達維多維茨 (Paul Davidovits) 和大衛·埃格爾 (David Egger) 于1969年以氦氖激光器為激發光源，制成了一臺激光掃描顯微鏡原型機 。
1978年，德國的托馬斯·克里默 (Thomas Cremer) 和克里斯托夫·克里默(Christoph Cremer)兄弟首次提出了共聚焦激光掃描顯微鏡 (Confocal Laser Scanning Microscope，簡稱CLSM) 的設計方案：在熒光顯微鏡成像的基礎上加裝激光掃描裝置，用激光聚焦逐點掃描方式結合熒光標記生物樣品的三維探測方法，通過計算機處理手段重構生成三維圖像(與掃描電子顯微鏡類似) 。
真正商業化的共聚焦激光掃描顯微鏡于1987年問世 。
克里斯托夫·克里默(Christoph Cremer)、托馬斯·克里默(Thomas Cremer)
共聚焦激光掃描顯微鏡
從理論上說，該項技術的光學成像空間分辨能力并未真正突破“阿貝極限”，但其所得的物像分辨率比傳統的光學成像提高了30%~40%，大大優化了成像質量 。
共聚焦激光掃描顯微鏡現已成為使用廣泛的高分辨率三維光學成像工具，通過移動透鏡系統對半透明物體進行三維掃描，在計算機系統的輔助下，對樣品從外觀到內在、從靜態到動態、從形態到功能進行全方位的觀察 。
05 真正突破
對“阿貝極限”的真正挑戰要從20世紀90年代說起 。
1994年，德國的斯蒂芬·黑爾 (Stefan Hell) 提出了受激發射損耗 (STimulated Emission Depletion，簡稱STED) 技術，用以突破“阿貝極限”實現超高分辨率成像 。所謂“阿貝極限”，是光學元件的衍射效應造成的 。
光學顯微鏡的照明光經光學系統聚焦后在樣品上形成的光斑實際上是個光的衍射斑，在此斑范圍內的樣品會發出照明光引發的熒光，使這部分樣品的細節信息無法被分辨 。要實現超越“阿貝極限”，關鍵是設法減少單個掃描點處的有效熒光發光面積 。
黑爾提出的方法十分巧妙，他設想同時使用兩束激光來照射樣品，一束為激發光，另外一束為空心形的受激發射損耗光，樣品上發生受激發射損耗效應的部分不能發出熒光，僅樣品的中心區域可發出輻射熒光，這樣就可達到大大降低熒光激發半徑的目的 。
可以想象，實現這項技術的難度相當大，黑爾于2000年終于用兩臺鈦寶石飛秒脈沖激光器實現了超高分辨率受激發射損耗顯微成像 。
斯蒂芬·黑爾(Stefan Hell)
除了受激發射損耗顯微技術，還有幾項重要的技術獲得了突破 。
美國的埃里克·白茲格 (Eric Betzig) 與威廉·莫爾納 (William Moerner) 分別獨立發現了單分子開關的方法，利用圖像多次疊加的技術得到單分子的精確定位，再將這些分子的熒光圖像合成，可獲得比傳統光學顯微鏡至少高10倍以上的分辨率 。
白茲格將該項技術稱為光激活定位顯微術 (Photo Activated Localization Microscopy，簡稱PALM) 。
埃里克·白茲格(Eric Betzig)
威廉·莫爾納(William Moerner)
美國哈佛大學的華裔女科學家莊小威 (Xiaowei Zhuang) 等人發明了利用有機染料 (不用熒光蛋白) 對熒光分子的可調控性對單分子進行精確定位，再用圖片重組方式獲得超高分辨率顯微鏡圖像的技術——隨機光學重建顯微術 (STochastic Optical Reconstruction Microscopy，簡稱STORM)。
莊小威積極推動了這項技術的發展，既實現了三維同時超分辨率顯現，又進一步提高了該技術的成像速率 (莊小威的成果與埃里克·白茲格的成果在2006年同時發表，只是莊小威投稿的日期晚了4個月) 。
莊小威(Xiaowei Zhuang)
正是由于上述多項技術的創新，光學顯微鏡最終實現了“阿貝極限”的真正突破 (分辨率達20納米)，使能進行活體物質觀察的光學顯微鏡又重新煥發出青春，這對多個前沿研究領域產生了重大影響，尤其是為常溫下活體生物學研究帶來了重大機遇 。
生物學家能夠實時觀察到生物分子如何在大腦神經細胞之間生成神經突觸，看到病毒顆粒侵入細胞的全過程，甚至還可追蹤帕金森、阿爾茲海默癥、亨廷頓癥患者體內相關蛋白的累積過程 (莫爾納、黑爾、白茲格三人被授予2014年諾貝爾化學獎(很遺憾莊小威未能獲獎)) 。
突破“阿貝極限”的光學顯微鏡
受激發射損耗顯微鏡(STED)(左)與一般光學顯微鏡圖像(右)的對比
共聚焦顯微鏡(CLSM)(左)與受激發射損耗顯微鏡(STED)圖像(右)的對比
難能可貴的是，黑爾在獲諾貝爾獎之后給自己制定了進一步提高分辨率的奮斗目標——被他稱為“后諾獎超分辨率” 。
2017年初，他的團隊在Science發表了題為“Science-2017-Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes”的論文，介紹了結合了STED、PLAM和STORM技術優勢的MINFLUX超分辨率熒光顯微鏡 (也稱為納米顯微鏡)。研究團隊的實驗實現了6納米的分辨率，他們的目標是實現1納米的分辨率，使生物學家不僅可看清病毒的結構，還可清晰地觀察病毒感染細胞的整個過程，最終找到滅殺病毒的有效方法 。
斯蒂芬·黑爾(Stefan Hell)和他的MINFLUX研究團隊
共聚焦顯微鏡圖像(上左)受激發射損耗顯微鏡(STED)圖像(上右)、超分辨率熒光顯微鏡(MINFLUX)圖像(下)的對比
據最新報道，黑爾的MINFLUX團隊又取得了新進展，實現了細胞中3D多色、優于1納米分辨率的成像，題為“MINFLUX nanoscopy delivers 3D multicolor nanometer resolution in cells”的論文2020年1月13日發表在Nature Methods 。
黑爾MINFLUX研究團隊取得的最新進展
雙色3D MINFLUX納米顯微鏡圖像顯示的細胞分布及蛋白質距離(上圖)，傳統顯微鏡圖像(下圖左)
生命體與成像設備分辨率的對應關系示意圖
06 結語
“阿貝極限”是恩斯特·阿貝 (Ernst Abbe) 1873年提出的 。根據阿貝的理論，光的基本衍射性質決定了以可見光 (波長范圍在0.38~0.78微米) 作為光源的光學顯微鏡無法實現0.2微米 (約可見光波長的二分之一) 以下的分辨率 。
在一代又一代科學家堅持不懈的努力之下，百余年之后的21世紀初，光學顯微鏡終于實現了“阿貝極限”的真正突破！超高分辨率的光學顯微鏡使科學家們能深入了解病毒在活細胞內感染、復制及釋放的整個動態過程，為人類攻克致病病毒提供了有力的工具 。
“阿貝極限”的真正突破經歷了百余年，衷心地向為此做出杰出貢獻的科學家們表示深深的敬意！
注：本文經授權轉載自微信公眾號“中科院高能所” 。

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