酶切位點的距離太小（小于10bp），影響限制性內切酶對切點的識別，不利于空載體的雙酶切 。
【酶切位點怎么選擇】方法：
1、一般目的基因用于克隆表達的情況下，酶切位點的選擇要考慮到：目的基因片段內部不含有所選的酶切位點（不然鑒定陽性重組子雙酶切時會將目的基因切斷）
2、實驗后繼應用的所有載體(真核、原核、酵母、昆蟲)都盡可能含有所選的酶切位點．并且要保證在載體上的插入方向正確（定向克隆） 。（不然換載體表達時，還要重新設計引物，以引進新的酶切位點 。）
3、盡可能選比較常用的酶切位點 。

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