酵母雙雜交酵母雙雜交實驗 _知識經驗

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大家好,小跳來為大家解答以上的問題。酵母雙雜交實驗，酵母雙雜交這個很多人還不知道,現在讓我們一起來看看吧！
1、酵母雙雜交系統由 Fields和Song等首先在研究真核基因轉錄調控中建立 i。
2、典型的真核生長轉錄因子，如GAL4、GCN4、等都含有二個不同的結構域: DNA結合結構域(DNA-binding domain)和轉錄激活結構域(transcription-activating domain) 。
3、前者可識別DNA上的特異序列，并使轉錄激活結構域定位于所調節的基因的上游，轉錄激活結構域可同轉錄復合體的其他成分作用，啟動它所調節的基因的轉錄。
4、二個結構域不但可在其連接區適當部位打開，仍具有各自的功能。
5、而且不同兩結構域可重建發揮轉錄激活作用。
6、酵母雙雜交系統利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白－蛋白的相互作用。
7、主要有二類載體: a 含DNA -binding domain的載體; b 含DNA-activating domain的載體。
8、上述二類載體在構建融合基因時，測試蛋白基因與結構域基因必須在閱讀框內融合。
9、融合基因在報告株中表達，其表達產物只有定位于核內才能驅動報告基因的轉錄。
10、例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequenc[利用酵母雙雜交篩選基因]利用酵母雙雜交篩選基因e)，而GAL4-ad沒有。
11、因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端應克隆來自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。
12、目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli轉錄抑制因子)的DNA-bd編碼序列。
13、常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和皰疹病毒VP16的編碼序列等。
14、雙雜交系統的另一個重要的元件是報道株。
15、報道株指經改造的、含報道基因(reporter gene)的重組質粒的宿主細胞。
16、最常用的是酵母細胞，酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統具有許多優點: 〈1〉易于轉化、便于回收擴增質粒。
17、〈2〉具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因。
18、〈3〉酵母的內源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結合。
19、一般編碼一個蛋白的基因融合到明確的轉錄調控因子的DNA－結合結構域(如GAL4-bd， LexA-bd)；另一個基因融合到轉錄激活結構域(如GAL4-ad，VP16) 。
20、激活結構域融合基因轉入表達結合結構域融合基因的酵母細胞系中，蛋白間的作用使得轉錄因子重建導致相鄰的報道基因表達(如lacZ)，從而可分析蛋白間的結合作用。
21、酵母雙雜交系統能在體內測定蛋白質的結合作用，具有高度敏感性。
22、主要是由于：①采用高拷貝和強啟動子的表達載體使雜合蛋白過量表達。
23、②信號測定是在自然平衡濃度條件下進行，而如免疫共沉淀等物理方法為達到此條件需進行多次洗滌，降低了信號強度。
24、③雜交蛋白間穩定度可被激活結構域和結合結構域結合形成轉錄起始復合物而增強，后者又與啟動子DNA結合，此三元復合體使其中各組分的結合趨于穩定。
25、④通過mRNA產生多種穩定的酶使信號放大。
26、同時，酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表達等檢測方法均很敏感。
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