影響退火溫度PCR反應特異性的重要因素 。
引物與模板復性所需的退火溫度取決于引物的長度、堿基組成及其濃度 。引物越短，引物中的引物越短G C含量越低，所需的退火溫度越低 。雖然降低退火溫度可能會增加產量的擴大，但引物與模板之間的不匹配也會增加，導致非特異性增加 。
【退火溫度是影響PCR反應特異性的重要因素 退火溫度的高低由什么因素決定】相反，雖然提高退火溫度可以提高反應的特異性，但會降低擴展效率，甚至沒有擴展產品 。引物的退火溫度可以通過Tm=4(G C) 2(A T)公式組略估算，一般計算Tm降低5攝氏度的值非常適合反應設計退火溫度 。

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