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空間轉錄組學新突破：擺好聚光燈，讓RNA自己說話！( 二 )

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空間轉錄組學新突破：擺好聚光燈，讓RNA自己說話！
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【空間轉錄組學新突破：擺好聚光燈，讓RNA自己說話！】圖3Light-Seq的概覽（圖源：[2]）
Light-Seq項目由Jocelyn（Josie）Kishi博士、SinemSaka博士和NinningLiu博士以及EmmaWest博士牽頭 。 2019年 ， Kish、Saka和West共同開發了一種名為SABER-FISH的空間轉錄組學方法 ， 該方法用于直接在完整組織中對基因表達進行成像 ， 能夠在固定的細胞和組織中將RNA和DNAFISH信號放大5到450倍 。 盡管如此 ， “距離捕捉細胞完整的基因表達程序還有好幾個數量級的差距 。 每個細胞有數千個不同的RNA分子 ， RNA分子過于密集 ， 無法用目前的成像技術完整捕獲 。 ”Kishi說 ， “而Light-Seq借助更高分辨率的DNA標簽和NGS全轉錄組測序 ， 兩全其美地解決了這個問題 。 ”
首先 ， DNA引物與細胞中的RNA分子進行堿基配對 ， 以RNA為模板擴建出RNA的副本 ， 即互補DNA（complementaryDNA ， cDNA） 。 然后 ， 通過紫外光的照射 ， 將含有超快光交聯劑的標簽DNA通過光交聯反應“粘到”目標區域的cDNA上 ， 而未被紫外光照射的區域 ， 標簽DNA會在之后的步驟中被洗脫 ， 這樣就對感興趣的區域打上了標記 。 若是使用不同的標簽配合照射不同區域的紫外光重復該過程 ， 則能標記更多的區域 。
空間轉錄組學新突破：擺好聚光燈，讓RNA自己說話！
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圖4DNA光刻進行空間尋址標記（圖源：[2]）
接下來 ， 為了使NGS能夠讀取到“貼好標簽“的目標cDNA序列 ， 使用特定的酶水解了RNA-cDNA雜交體中的RNA ， 將“貼好標簽”的cDNA提取出來 。 隨后 ， 利用研究人員新開發的一種基于納米驅動技術的拼接反應 ， 將標簽DNA和目標cDNA序列一起“抄錄”到新的DNA單鏈中 。 這些新的DNA單鏈則可以用于后續的NGS測序（圖5） 。
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圖5拼接反應與Light-Seq的工作流程（圖源：[2]）
為了驗證該技術的細胞選擇能力和“貼標簽”的能力 ， 研究人員將小鼠3T3細胞和穩定表達eGFP的人類HEK細胞混合進行測試 。 基于eGFP表達和細胞形態信息 ， 研究人員對細胞進行了手動選擇并標記以不同的“標簽” 。 結果表明 ， 小鼠和人類圖譜對于其各自的“標簽”具有良好的區分率 ， 尤其是eGFPreads歸類到人類“標簽”的正確率高達93±0.5% 。 序列提取后 ， 又對樣本進行了多重免疫熒光 ， 驗證了樣本具備進行二次分析的完整性 。
在培養細胞中首次驗證Light-Seq之后 ， 研究人員希望將其應用于更復雜的組織 ， 因為組織樣本中特定細胞群的RNA測序仍然充滿挑戰性 ， 尤其是當靶細胞很少或難以分離時 。 為此 ， Kishi ， Saka ， Liu和West聯手 ， 將Light-Seq應用于小鼠的視網膜切片 。 研究人員手動劃分了視網膜經典具備不用功能的三個細胞層 。 結果表明 ， Light-Seq達到了與單細胞測序方法相當的序列覆蓋率 ， 并發現視網膜的三個主要層之間富集了數千個RNA（圖6） 。 此外 ， 樣本保持了完整 ， 仍能進一步對蛋白質和其他生物分子進行成像 。
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圖6LightSeq應用于小鼠視網膜切片（圖源：[2]）
將Light-Seq發揮到極致 ， 研究人員分離出了一種非常罕見的細胞類型的完整轉錄組 ， 這種細胞與視網膜內的其他細胞聯系極其復雜 ， 因此難以分離 。 “Light-Seq還提取了該細胞中表達水平極低的特異性RNA ， 以及據我們所知前人從未描述過的數十種特異性生物標志物RNA ， 這為研究這種罕見細胞類型開辟了新的機會 。 ”West說 。
將空間轉錄組學領域向NGS敞開還帶來了有關單個RNA種類水平的信息 。 Kishi表示：“Light-Seq可以確定RNA結構的自然變異 。 ”展望未來 ， Kishi對Light-Seq應用于更好地了解免疫系統、疾病傳播細胞以及基因和細胞治療等不同治療策略之間的相互作用充滿興趣 ， 現在 ， 她正積極地與合作者們一起尋求將Light-Seq商業化的道路 。