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測評盤點|多重免疫熒光/多重免疫組化及腫瘤微環境系列1

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泰立瑞病理
往期回顧：
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組織多重免疫染色技術的方法學概述 關鍵詞：腫瘤微環境、免疫治療、多重免疫組化、多重免疫熒光、DSP、組織質譜分析、PD-1、PD-L1、免疫細胞、流式細胞儀、癌癥預后、全自動免疫組化染色機蛋白質水平的多重免疫組織化學（mIHC）和多重免疫熒光（mIF）能分析、量化腫瘤中免疫細胞亞群、其功能狀態及其在腫瘤微環境中的空間排列等 ， 是目前檢測腫瘤微環境免疫狀態的核心技術 。 在準備開展mIHC/mIHC時樣本數量、多通道成像、預算和是否有圖像分析能力是重點考慮的事情 。 由于所有多重免疫組化（mIHC/mIF）都有創建和驗證多種抗體組合的過程 ， 我們南京泰立瑞的建議基本上都是關于創建一個由10-60個抗體組成的多重免疫組化檢測模塊的 。 我們提供了一個基于多重mIHC/mIF的初級介紹 ， 整理了關鍵資料 ， 并概述了計劃和執行此類實驗的主要考慮因素 ， 主要受眾是基礎或轉化醫療研發人員 ， 或準備開展mIHC/mIF常規檢測前建立方法學的臨床病理、檢驗人員 。本篇是mIHC/mIF系列的第一篇 ， 給感興趣者一個整個領域的概況 。領域簡介 腫瘤微環境（TME）中宿主和腫瘤細胞有著復雜交互 ， 包括多種免疫細胞（T和B淋巴細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞和不同的髓樣細胞巨噬細胞和粒細胞等類型） ， 具有特異性免疫活性的蛋白質表達 ， 免疫程序性細胞死亡檢查點蛋白質-1（PD-1）/程序性細胞死亡配體1（PD-L1）、細胞因子（如干擾素γ）和基質細胞、血管和成纖維細胞等 ， 它們都有獨特生物學意義 。 其中一些 ， 如PD-L1在腫瘤和/或免疫細胞的表達 ， 及治療前腫瘤標本中的CD8+數量、T細胞浸潤的密度等與腫瘤對免疫反應相關檢查點抑制劑（PD-1/PD-L1抑制劑）的臨床治療反應高度相關 。 此外 ， 研究腫瘤對免疫治療的反應有助于理解免疫治療是如何重塑腫瘤免疫微環境 ， 理解這些治療的作用機制和發現提示早期治療效果的生物標志物 。 基于這些早期對TME成功研究 ， 引起了人們試圖擴展對TME描述的維度和指標 ， 旨在識別新的可用于物精確醫學的生物標志物 。目前具有最大臨床應用價值的生物標記物來源于與腫瘤直接相關的細胞群 。 外周血免疫細胞與TME中的細胞組成相關性較差 ， 因此 ， 迄今為止 ， 外周血研究對實體瘤免疫治療的價值有限 。 實體瘤標本的研究也也面臨實體瘤組織可用性有限、在石蠟包埋前腫瘤樣本處理的一致性差、標記物表達的空間異質性以及圍繞原位檢測復雜或罕見細胞表型的挑戰 。 流式細胞術是一種強大的細胞表型分析方法 ， 但要求新鮮組織、低細胞產量和空間信息的丟失限制了此類方法的常規應用 ， 目前主要應用于外周血的細胞表型分析 。美國TCGA項目中使用的DNA和RNA組學方法為探索腫瘤分類以及免疫浸潤的預后意義提供了大量數據集 。 但這些分析的輸入異質性很強 ， 因為樣本包括所有TME細胞以及一定比例的非腫瘤組織 。 盡管生物信息學計算方法已被用于反褶積mRNA表達數據 ， 因此單個細胞類型可以進行虛擬表達譜分析 ， 但單細胞的空間分布信息都丟失殆盡 。 類似地 ， 單細胞RNA-seq允許對單個細胞的表達譜進行表征分析 ， 但也丟失了空間信息 。 相比之下 ， 免疫組織化學（IHC）可以區分TME內表達相同蛋白質的不同細胞類型 ， 并且可以描述其密度和空間分布 。 IHC還可以提供標記強度的定量評估 。 免疫熒光（IF）較IHC的一個顯著優勢是 ， 即能夠檢測更大蛋白質動態表達范圍 。 最近的多項研究證實 ， 與DNA NGS測序、RNA表達譜GEP及單一PD-1 IHC檢測相比 ， 基于mIF/mIHC多種指標的腫瘤微環境（TME）綜合指數是最好的生物標志物, 在預測抗PD-（L）1治療的客觀反應方面比其他方法具有更高的性能 。 這些發現強調了共表達和空間分布指標的潛在生物標志物價值 ?？傊?， 免疫系統與腫瘤細胞之間的相互作用是癌癥預后和治療的重要特征 。 蛋白質水平的多重免疫組織化學（mIHC）和多重免疫熒光（mIF）分析是用于量化免疫細胞亞群、其功能狀態及其在腫瘤微環境中的空間排列的技術 ， 是目前檢測腫瘤微環境免疫狀態的核心技術 。 行業普遍認為 ， 我們需要mIHC測試腫瘤微環境來理解患者的免疫原性 ， 就像需要NGS來理解突變類型和突變負荷 ， 需要液體活檢方法持續監測治療后的反應 ， 未來對腫瘤患者進行mIHC和NGS聯合檢測應該成為標配 。多重技術可高精度和準確度展示組織中單個細胞表達的2-50個標記 。 mIHC可以通過一次向一張切片上添加多個抗體及標記（例如VentanaRoche或Biocare Medical）或使用一次一個抗體的染色、剝離、照相循環方法來進行 。 mIF技術有多個平臺 ， 包括可支持4-5重的標準IF分析技術及可支持6-8重分析的多光譜技術（Vectra 3.0TM/Polaris） 。 更高的多重染色方法包括多離子束成像（multiplex ion beam imaging）、飛行時間成像（MIBI-TOF）、成像質量流式細胞術（imaging mass cytometry-IMC)和數字空間分析（digital spatial profiling-DSP）等 。 我們簡要總結了這些不同方法的基本原則 ， 以及每種方法的優缺點（表1、圖1中） 。 實踐中 ， 每種方法都需要優化和驗證 。表一：不同的組織多重免疫技術的比較