1. 首頁 > 健康養生 > >

一雙“慧眼”看穿凍卵活性，拉曼光譜的確“靠譜”( 二 )

健康知識養生常識


文章圖片
圖1研究成果（圖源：[1]）
此研究以卵母細胞作為研究對象 ， 使用甘油/丙二醇（Propyleneglycol ， PG）作為冷凍保護劑 ， 依據標準冷凍方案對卵母細胞進行冷凍保存 。 具體地 ， 該冷凍方案步驟包含四個階段：（i）以1℃/min的冷卻速率從室溫冷卻至-7℃；（ii）用冷銅線碰觸樣品以形成冰核；（iii）在-7℃下保持10分鐘；（iv）以0.3℃/min的速度進一步冷卻至-25℃ 。 在大多數卵母細胞和胚胎的冷凍程序中在-7℃下保持10分鐘以形成冰核 ， 冰核形成是冰結晶所必需階段 ， 冷卻程序在特定溫度下暫停以進行拉曼檢測 。
拉曼采集平臺采用固體激光器（激光波長為532.1nm） ， 100×物鏡（NA=0.75） ， 橫向分辨率~0.6μm ， 縱向分辨率~10μm ， 光譜分辨率為2.5cm-1；以掃描模式測量了一組拉曼光譜 ， 并在指定坐標處探測了拉曼散射；光譜檢測范圍為1000至3200cm-1 ， 曝光時間3s；在單個拉曼成像實驗中測量約2500條光譜 。 初步數據處理包括測量光譜中高能離子宇宙線去除、基線校正等 。 進一步的多變量分析包括用于奇異值分解 ， 以及使用交替最小二乘算法對拉曼光譜進行非負矩陣分解等數據處理方法 。
研究結果發現：
1、不同溫度下脂滴的拉曼光譜特征具有一定規律性
如圖2所示 ， 在不同的冷凍溫度下收集卵母細胞的拉曼光譜 ， 并分析對脂質相變敏感的aCH2鍵在拉曼頻移2882cm-1處的特征表達 ， 其峰值用來表達不同溫度下的脂質相態；通過在~2850cm-1處具有強烈拉伸對稱CH2(sCH2)峰 ， 可以在拉曼圖中識別出富含脂質的物質 。 經過統計 ， 在不同溫度下脂滴的光譜特征具有一定規律 ， 不同溫度時光譜峰值均數：n=1666@-25℃；n＝1214@-15℃；n＝636@-3℃；n=478@+5℃；n=638@+15℃；在-3℃及以下測量的拉曼光譜（圖2b）表明拉伸反對稱CH2(aCH2)峰對LPT敏感 。 以上統計的數據表明 ， LPT開始發生的溫度是在+5和-3℃之間 。
一雙“慧眼”看穿凍卵活性，拉曼光譜的確“靠譜”
文章圖片
圖2卵母細胞在不同溫度下拉曼光譜的平均光譜（圖源：[1]）
注：（a）不同溫度下（-25℃~+15℃） ， 卵母細胞中脂滴對應的平均拉曼光譜；CH譜帶的拉曼特征區域；（b）表示鍵在2882處的特征峰 。 虛線是統計基線 。
低溫下卵母細胞以及胚胎中 ， aCH2峰的強度大約是sCH2峰強度的0.7倍 。 該峰的強度低可能有兩種不同的情況導致 ， 第一種可能的情況是所有脂質分子都處于大致相同的構相狀態 ， 隨著溫度的降低逐漸變為更有序的構相狀態 ， 這種情況對應于均勻的擴散相變；第二種情況涉及脂質分子以有序和無序的相態共存 ， 在這種情況下 ， 處于無序相態的脂質比例會隨著溫度升高而降低 。
2、拉曼光譜用于檢測冷凍卵細胞中脂質相分布不均勻性
為了證實LD中是否存在脂質相態共存 ， 研究人員使用PG作為冷凍保護劑 ， 在T=-25℃條件下處理10分鐘后進行兩個拉曼成像實驗：第一個實驗是在-25℃下初步暴露兩小時后使用甘油作為冷凍保護劑進行的；第二個實驗用于揭示在其他條件下是否會觀察到相態共存效應 。
研究人員使用NMF-ALS方法構建拉曼譜圖 ， 在三個光譜分量的線性組合上分解所有拉曼光譜：這些光譜分量對應于有序相態脂質（SOL）、無序相態脂質（SDL）和細胞質（SC）的貢獻 。 對應的SOL在2882сm-1處有一個CH2峰 ， sCH模式下的拉曼位移置為2845cm-1；SDL無aCH2的顯著峰 ， 2849сm-1處有CH2峰；SC為冷凍保護劑（甘油或PG ， 取決于實驗條件）和細胞質蛋白的水性混合物 。
圖3顯示了在-25℃甘油溶液中冷凍的卵母細胞內部有序（IOL）和無序（IDL）相狀態的脂質的明場圖像（3a）和拉曼成像圖（3b） 。 明場顯微鏡觀察仍然無法判斷脂質空間分布的不均勻性（圖3a） ， 但拉曼成像圖譜可以看出不同相態的脂質在微米尺度上分布不均勻（圖3b） 。 根據圖3c中脂質光譜1和2的比較 ， aCH2拉曼峰（IaCH）的信噪比估值大于10 。 因此 ， 拉曼光譜1和2之間的IaCH差異是顯著的 。