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陽性|孫逸仙紀念醫(yī)院團隊破解HER2陽性乳腺癌對曲妥珠單抗耐藥之謎( 二 )

腫瘤環(huán)狀曲妥珠之謎分子單抗蛋白陽性惡性腫瘤乳腺癌患者研究癌細胞cirCDYL


陽性|孫逸仙紀念醫(yī)院團隊破解HER2陽性乳腺癌對曲妥珠單抗耐藥之謎
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▲ PDX實驗發(fā)現(xiàn)cirCDYL2與HER2陽性乳腺癌細胞產生曲妥珠單抗耐藥有關
那到底cirCDYL2是怎么發(fā)揮作用的？為了找到這個問題的答案 ， 研究者不得不抽絲剝繭 ， 一步一步接近真相 。
首先他們發(fā)現(xiàn) HER2與cirCDYL2之間沒有直接的調控關系 ， 其中一個分子的表達量變化 ， 不會直接影響另一個分子 。 因此 ， 他們推測cirCDYL2應該跟HER2相關的信號通路蛋白有相互作用 。
通過蛋白質體外結合實驗、環(huán)狀RNA下拉實驗、免疫沉淀等實驗結果 ， 他們終于確定cirCDYL2與GRB7信號蛋白存在相互作用 。cirCDYL2是通過GRB7蛋白去促進HER2+乳腺癌細胞的曲妥珠單抗耐藥 。
再進一步分析這兩個分子之間的相互作用 ， 他們發(fā)現(xiàn)cirCDYL2使GRB7蛋白變得穩(wěn)定 ， 但敲除cirCDYL2對GRB7的mRNA表達水平又沒有顯著影響 。 因此研究者們判斷 cirCDYL2對GRB7的作用是發(fā)生在轉錄翻譯之后 。
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▲ cirCDYL2使GRB7蛋白變得穩(wěn)定
之前的研究已經發(fā)現(xiàn) ， GRB7可以通過泛素化完成降解[6] ， 因此研究人員猜想cirCDYL2能影響GRB7的泛素化水平 。
隨后他們發(fā)現(xiàn) ， 將細胞內的Pin1蛋白基因 （GRB7的穩(wěn)定性的調控蛋白）敲除 ， 可以增加GRB7蛋白的穩(wěn)定性 ， 轉染Pin1會提升GRB7蛋白泛素化水平 。 免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn) ， 過表達cirCDYL2可以在過表達Pin1的細胞環(huán)境下 ， 提升GRB7蛋白穩(wěn)定性 ， 相比僅過表達Pin1的細胞 ， 同時過表達cirCDYL2和Pin1的細胞有更多GRB7蛋白可以被沉淀下來 。
所以 ，cirCDYL2是通過干預Pin1蛋白來抑制GRB7的泛素化降解 ， 導致GRB7的表達量上調 。
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▲ Pin1加劇GRB7蛋白降解 ， CirCDYL2抑制Pin1維持GRB7蛋白穩(wěn)定
不過 ， 也有研究表明 ， GRB7只是一個銜接蛋白 ， 是通過與FAK蛋白結合來維持AKT和ERK信號蛋白的磷酸化激活狀態(tài) ， 進而促進HER2下游信號傳導[7] 。
研究者們利用RNA結合蛋白免疫沉淀等實驗發(fā)現(xiàn) ， FAK蛋白與circCDYL2存在相互作用 。 而且相比對照組 ， 過表達cirCDYL2的細胞中 ， 能夠發(fā)現(xiàn)更多FAK與GRB7蛋白結合的現(xiàn)象 ， 即 circCDYL2可促進GRB7與FAK結合 。
而將FAK沉默后 ， 對曲妥珠單抗耐藥的細胞中P-AKT和P-ERK變少了 ， 這意味著耐藥性減弱 。
這說明 cirCDYL2是通過FAK來促進HER2陽性乳腺癌細胞曲妥珠單抗耐藥 。
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▲ circCDYL2-GRB7-FAK結合機制
最后 ， 研究者要在體內證明HER2陽性乳腺癌對曲妥珠單抗耐藥確實與cirCDYL2-GRB7-FAK的作用機制有關 。
他們將SK-BR-3細胞改造成過表達cirCDYL2的P-SK-BR-3細胞和敲除cirCDYL2的SK-BR-3-R細胞 ， 并原位注射到小鼠乳房脂肪墊 ， 實驗組小鼠一周注射兩次曲妥珠單抗 ， 44天后將腫瘤取出觀察結果 。
結果發(fā)現(xiàn) ， 僅敲除cirCDYL2或者注射曲妥珠單抗這兩種手段對已經耐藥的腫瘤生長無明顯影響 ， 但在敲除cirCDYL2且注射曲妥珠單抗的實驗組 ， 腫瘤生長被顯著抑制 。 這說明 敲除cirCDYL2可以逆轉腫瘤對曲妥珠單抗的耐藥 。
更有趣的是 ， 使用FAK或者GRB7蛋白抑制劑干預 ， 也可以達到敲除cirCDYL2類似的效果 。 即使是過表達cirCDYL2的腫瘤 ， 使用FAK或者GRB7蛋白抑制劑也可以緩解曲妥珠單抗耐藥 。
因此 ，cirCDYL2確實促進了曲妥珠單抗耐藥 ， FAK及GRB7蛋白抑制劑可緩解曲妥珠單抗耐藥 。