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經驗分享：納米抗體技術應用的最新進展( 二 )

健康知識養生常識


中國農業大學Liu等[37]用半抗原CBR1與鑰孔血藍蛋白(keyholelimpethemocyanin,KLH)偶聯 ， 將CBR1-KLH進行皮下免疫羊駝 ， 然后經提取總RNA、PCR擴增VHH片段、酶切、轉化等步驟后成功構建VHH庫 ， 構建的文庫大小約為1×108CFU/mL ， 經過洗脫、淘選、純化等一系列過程后制備了甲萘威特異性VHHs ， 開發了基于Nb的免疫測定方法檢測谷物中的廣譜氨基甲酸酯類殺蟲劑甲萘威(carbaryl) ， 且在谷物樣品中的可重復性和再現性良好 ， 本課題組參與了其中的部分研究工作 ， 對基于Nb的小分子檢測有了一定的研究基礎 。
Nb在農藥獸藥殘留以及重金屬檢測中表現出較高的應用價值 。 Li等[38]研究發現納米抗體-堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)對除草劑2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-d)表現出優異的敏感性和特異性(IC50=29.2ng/mL) ， 2,4-d深埋在CDR3和CDR2形成的袋中 ， NB3-9的結合袋通過氫鍵和疏水力與2,4-d的相互作用 ， 在此基礎上開發了以納米抗體-堿性磷酸酶(AP)融合為基礎的2,4-d一步熒光酶免疫測定法(one-stepfluorescentenzymeimmunoassay,FLEIA) ， 通過分析比較確定了FLEIA法可作為一種監測環境中2,4-d殘留的便捷工具 。 3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)被廣泛用作人類擬除蟲菊酯類殺蟲劑暴露的常見生物標志物 ， 近期El-Moghazy等[39]研制了一種基于納米抗體的新型電化學競爭免疫傳感器用于3-PBA的快速檢測 ， 檢測限為0.64pg/mL ， 檢測限遠低于膠體金/單克隆抗體/側向流動免疫分析方法 ， LOD為130ng/mL[40] 。
Nb在檢測食品和環境真菌毒素方面展現了強大的應用前景 。 Wang等[41]開發并優化了PO8-VHH的納米抗體-多克隆抗體夾心ELISA法測定農產品中的曲霉病菌 ， 能夠達到1μg/mL濃度的檢測效果 ， 進而監測農產品曲霉污染 。 Tang等[42]使用OTA和抗OTANb分別與兩種尺寸的高效熒光標簽-量子點(quantumdot,QD)共價耦合 ， 制備了OTA標記的GQD結合物(OTA-GQD)和Nb28標記的RQD偶聯物(Nb-RQD)分別作為能量供體和受體 ， 如圖2所示 ， 開發出一種Nb-FRET(熒光共振能量轉移)免疫傳感器用于檢測谷物樣品中赭曲霉毒素A(ochratoxin,OTA) ， 易于表達、小尺寸的Nbs可以縮短兩個QD之間的有效距離 ， 從而提高檢測靈敏度 ， 單步測定可以在5min內完成 ， 檢測限為5pg/mL 。
經驗分享：納米抗體技術應用的最新進展
文章圖片
Nb-FRET免疫傳感器
2.2病原體感染診斷工具
納米抗體在病原菌引起的感染診斷方面的突出表現 ， 可以為疾病的早期診斷提供便捷 ， 幫助我們快速控制疾病的惡化并達到治療的目的 。
牛結核病是一種主要由于感染結核分枝桿菌發病且死亡率極高的慢性人畜共患傳染病 ， 研究發現牛結核分枝桿菌表達多個分泌蛋白 ， 其中Ag85B是牛結核分枝桿菌主要的分泌蛋白之一[43] ， 本課題組已經成功構建了抗牛結核分枝桿菌VHH抗體庫 ， 且以Ag85B蛋白為抗原 ， 采用噬菌體展示技術經淘選并富集及蛋白芯片互作技術篩選得到抗Ag85B的VHH抗體 ， 為牛結核病的診斷和治療奠定基礎[44] 。
沙門氏菌引發的食物中毒占據食物中毒首列 ， He等[45]在對免疫駱駝納米抗體庫進行生物淘選后 ， 首次分離出了針對腸炎沙門氏菌的納米抗體 ， 將C端含有6×His標簽標記的3個納米抗體的質粒亞克隆到大腸桿菌Top10F′中 ， 通過異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropylβ-d-thiogalactoside,IPTG)誘導過夜表達 ， 并用Ni-NTA親和柱進行純化 ， 最后開發了一種基于Nb13的夾心ELISA法用于牛奶樣品中的腸炎沙門氏菌檢測 ， 檢測限可達1.4×105CFU/mL 。
錐蟲病是一種由寄生蟲引起的睡眠病 。 Pinto等[46]通過質譜選擇后鑒定出一對特異性針對錐蟲丙酮酸激酶(TcoPYK)的Nb對(Nb44/Nb42) ， 并建立了兩種異源夾心試驗法：側向流動側流法(LFAs)和ELISA法用于檢測感染小鼠和牛血漿樣本中的寄生蟲病 ， 測定LOD分別為220ng/mL和14ng/mL ， LFAs展示出了良好的特異性(92%) 。