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豌豆肽通過Keap1/Nrf2/TXNIP信號通路減輕鉛誘導的PC12細胞氧化應激損傷( 二 )

健康知識養生常識


實驗方法及結果
1、建立細胞模型：首先 ， 將處于對數生長階段的PC12細胞在6孔板中預孵育24h 。 然后 ， 用含有或不含有肽的新鮮培養基替換培養基4h 。 最后 ， 用含有鉛或不含有鉛的新鮮培養液替換培養基24h ， 用于隨后的測定 。
2、CCK檢測細胞活力：使用不同濃度的Pb（0~160μM）處理PC12細胞24h ， 用CCK-8檢測細胞活力 ， 結果如圖4A所示；使用不同濃度 ， 不同種類的豌豆肽（0~200μMPP3/4/6）處理PC12細胞4h ， 用CCK-8檢測細胞活力 ， 結果如圖4B/C/D所示；使用200μM的豌豆肽（PP1~PP6）預處理PC12細胞4h ， 再用10μM的Pb處理24h ， 用CCK-8檢測細胞活力 ， 結果如圖4E所示 。
豌豆肽通過Keap1/Nrf2/TXNIP信號通路減輕鉛誘導的PC12細胞氧化應激損傷
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圖4不同處理對PC12細胞活力的影響 。 （A）Pb對PC12細胞活力的影響；PP3（B）、PP4（C）和PP6（D）對PC12細胞活力的影響；（E）PP1~6對Pb暴露PC12細胞活力的影響 。 柱狀圖的值表示平均值±SD（n≥3） 。 不同上標字母表示差異（P<0.05） 。
3、活性氧ROS水平的檢測：根據文獻選擇80μMVC作為對照組評估豌豆肽抗氧化性能的標準（Anetal.,2014） 。 使用200μM的PP3/4/6和80μM的VC處理PC12細胞4h ， 用試劑盒檢測ROS水平 ， 結果如圖5A所示；使用200μM的PP3/4/6和80μM的VC預處理PC12細胞4h ， 再用10μM的Pb處理24h ， 用試劑盒檢測ROS水平 ， 結果如圖5B所示 。
豌豆肽通過Keap1/Nrf2/TXNIP信號通路減輕鉛誘導的PC12細胞氧化應激損傷
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圖5不同處理對PC12細胞內ROS的影響 。 （A）PP3、PP4、PP6和VC對PC12細胞內ROS的影響；（B）PP3、PP4、PP6和VC對Pb暴露PC12細胞內ROS的影響 。 柱狀圖的值表示平均值±SD（n≥3） 。 不同上標字母表示差異（P<0.05） 。
4、細胞氧化應激指標的檢測：使用200μM的PP3/4/6和80μM的VC處理PC12細胞4h ， 用試劑盒檢測抗氧化酶SOD、CAT、GR、GPx活性和丙二醛MDA含量 ， 結果如圖6A~E所示 ， 檢測GSH和GSSG水平 ， 結果如7A所示；使用200μM的PP3/4/6和80μM的VC預處理PC12細胞4h ， 再用10μM的Pb處理24h ， 檢測抗氧化酶SOD、CAT、GR、GPx活性和丙二醛MDA含量 ， 結果如圖6F~J所示 ， 檢測GSH和GSSG水平 ， 結果如圖7B所示 。
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圖6不同處理對PC12細胞氧化應激指標的影響 。 SOD結果如圖（A、F）所示；CAT結果如圖（B、G）所示；GR結果如圖（C、H）所示；GPx的結果如圖（D、I）所示；MDA的結果如圖（E、J）所示 。 柱狀圖的值表示平均值±SD（n≥3） 。 不同上標字母表示差異（P<0.05） 。
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圖7不同處理對PC12細胞GSH/GSSG的影響 。 （A）PP3、PP4、PP6和VC對PC12細胞GSH/GSSG的影響；（B）PP3、PP4、PP6和VC對Pb暴露PC12細胞GSH/GSSG的影響 。 柱狀圖的值表示平均值±SD（n≥3） 。 不同上標字母表示差異（P<0.05） 。
5.WesternBlot：使用200μM的PP3/4/6和80μM的VC預處理PC12細胞4h ， 再用10μM的Pb處理24h ， 檢測Keap1/Nrf2/TXNIP通路蛋白的表達 。 結果如圖8所示 。
豌豆肽通過Keap1/Nrf2/TXNIP信號通路減輕鉛誘導的PC12細胞氧化應激損傷
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圖8PP3、PP4、PP6和VC對Pb暴露的PC12細胞中Keap1、Nrf2和TXNIP蛋白表達的影響 。 （A）不同處理下PC12細胞中Keap1、Nrf2和TXNIP的蛋白質印跡結果；（B）不同處理下PC12細胞中Keap1、Nrf2和TXNIP蛋白相對表達量的變化 。
結論
鉛暴露可顯著降低PC12細胞的活力 ， 增加ROS和MDA水平 ， 降低SOD、CAT、GPx、GR和GSH/GSSG的活性 ， 上調PC12細胞中Keap1和TXNIP蛋白的表達 ， 下調Nrf2蛋白的表達 。 豌豆肽可以減輕鉛誘導的PC12細胞氧化應激損傷 ， 通過Keap1/Nrf2/TXNIP信號通路保護PC12細胞 。 該研究將為鉛神經毒性的深入研究提供新的視角 。