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治療|基因治療在IVA型粘多糖病中的應用

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治療|基因治療在IVA型粘多糖病中的應用
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IVA型粘多糖病（MPSIVA）又名Morquio A病 ， 是由N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶（GALNS）缺乏引起的 ， 導致硫酸角質素（KS）和硫酸軟骨素-6-積累 。 患者會出現嚴重的骨骼發育不良、早期軟骨退化以及危及生命的心臟和氣管并發癥 ， 但目前尚無治愈方法 。
基因治療作為一種新興的療法 ， 通過AAV等遞送系統補償突變基因的效價 ， 在眾多罕見病治療上展現出巨大的應用潛力 。 Bertolin等人在MPSIVA疾病模型中注射AAV9-Galns ， 發現GALNS的活性能長期（1年）恢復 ， 并且KS的表達水平恢復正常 ， 從而改善MPSIVA的癥狀 。 這項研究證明AAV9-Galns基因治療在治療MPSIVA的應用潛力 ， 為MPSIVA患者未來的臨床治療提供了強有力的理論基礎 。
接下來我們就詳細解讀這篇文獻 ， 再深入理解基因治療研究的常規套路吧 。
研究思路
01 構建MPSIVA大鼠疾病模型
↓
02 AAV9遞送系統的遞送效率檢測
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03 MPSIVA大鼠疾病模型的表型檢測與注射AAV9-Galns后的有效性評價
MPSIVA大鼠疾病模型的構建
作者利用CRISPR/Cas9技術構建含有錯義突變c.1156C>T的MPSIVA大鼠模型并且通過測序分析驗證了該點突變 ， GALNS點突變的產生導致GALNS蛋白的功能發生突變（p.Arg386Cys） 。 研究人員將雜合子大鼠（GALN+/?）與野生型大鼠（GALN+/+）回交 ， 以消除CRISPR/Cas9相關的脫靶效應（圖1a-c） 。 對GALN敲除大鼠進一步分析 ， 發現在這些大鼠所有的組織中均無法檢測到GALNS活性水平 ， 并且早在1個月大時 ， 肝臟和血清中的KS含量一直很高 ， 脛骨長度減少（圖1d-g） 。

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圖1. MPSIVA大鼠疾病模型的構建 。
AAV9在骨骼系統中具有良好的遞送效果
由于MPSIVA疾病的基因治療面臨的主要挑戰是沒有良好的遞送系統 ， 以增加局部GALNS的濃度 。 作者將AAV9-GFP注射至野生型雄性大鼠 ， 通過觀察熒光強度來評價AAV9遞送系統的效率 。 在股骨、脛骨生長板（GP）和骨內膜周圍的成骨細胞富集區、致密骨的內部細胞和關節軟骨中檢測到GFP陽性信號（圖2a） 。
此外 ， 在所有大鼠骨骼（股骨、脛骨、前肢骨、胸骨、肋骨和椎骨）和Morquio A大鼠的關鍵外周器官中也發現了高水平的GFP表達（圖2b、c） 。
然后對MPSIVA大鼠注射AAV9-Galns ， 載體基因組拷貝數分析表明 ， AAV9-Galns在骨骼（圖2d）和外周器官（圖2e）中有較好的轉導效率 。 表明AAV9在治療MPSIVA上具有很大的應用潛力 。

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圖2. AAV9在骨骼系統中具有良好的遞送效果 。
A. (I)致密骨(CB)； (II)生長板周圍區域(GP)；(III)關節；(IV)骨小梁；(V)骨內膜 。 B. F ， 股骨；Ti ， 脛骨；R ， 肋骨；S ， 胸骨；V ， 椎骨；FL ， 前肢骨骼；K ， 膝蓋骨；Fi ， 腓骨；Sc ， 肩胛骨；Hu ， 肱骨；T ， 氣管；H ， 心臟；L ， 肝臟；A ， 附睪白色脂肪組織（eWAT）；Lu ， 肺；Q ， 股四頭肌 。
注射AAV9-Galns能有效治療MPSIVA
身材矮小是MPSIVA患者的特點 。 MPSIVA雄性大鼠在第一個月齡期間顯示出與WT大鼠相似的體重 ， 但隨后觀察到體重和體型的顯著下降（圖3a、b） 。 并且MPSIVA大鼠的壽命也顯著縮短 ， 約30%的大鼠在2個月大時死亡（圖3c） 。
經過AAV9-Galns基因治療 ， MPSIVA大鼠的體重增加且存活率恢復正常（圖3a-c） ， 并且GALNS的活性和KS的水平恢復正常（圖3d-f） 。 在肝臟和白色脂肪組織（WAT）中也發現GALNS活性較高（圖3g、h） 。 GALNS活性提高使肝臟中KS含量正?；?， 僅儲存在Kupffer細胞和WAT中（圖3i-l） 。 此外 ， 肝臟β-己糖胺酶（溶酶體內穩態生物標記物）活性恢復（圖3m） 。