sgRNA|在iPS中利用CRISPRi系統發現病毒感染新機制——NEPA21高效基因轉染系統助力結果|細胞|系統|基因|研究|抑制

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）是一種嚴重的急性呼吸道傳染性疾病，其由急性呼吸綜合征冠狀病毒SARS-CoV-2感染所致。自COVID-19新冠肺炎疫情爆發至今，已兩年有余。除了疫苗接種，目前醫學界還沒有針對治療新冠的特效藥問世。而關于其感染機制的研究，對于新冠藥物的研發至關重要。
據報導，SARS-CoV-2 的感染需要許多受體和蛋白酶。在感染期間，SARS-CoV-2 刺突（ S ）蛋白與細胞表面表達的血管緊張素轉換酶 2 （ ACE2 ）結合，并被跨膜蛋白酶絲氨酸 2 （ TMPRSS2 ）等蛋白酶切割，導致 S 蛋白分裂為 S1 和 S2 結構域。SARS-CoV-2 通過 S2 結構域融合和侵入細胞。因此，SARS-CoV-2 感染被認為是依賴于宿主細胞中 ACE2 和 TMPRSS2 的表達。然而，除了 ACE2 和 TMPRSS2 之外的其他蛋白分子也在 SARS-CoV-2 感染中起著重要作用。
近期，有研究學者通過通過CRISPR/Cas9基因編輯系統和表達ACE2的人類誘導多能干細胞（iPS）檢測了神經纖毛蛋白 -1 （ NRP1 ）、堿性蛋白 BSG 、跨膜絲氨酸蛋白酶（ TMPRSS ）和組織蛋白酶（ CTS ）在 SARS-CoV-2 感染中的作用。該研究發現雙重敲降 TMPRSS2 和組織蛋白酶 B （ CTSB ）可將病毒載量降低至 0.036%±0.021%。CTPB 抑制劑 CA-074 甲酯和 TMPRSS2 抑制劑C amostat 的組合更將病毒載量降低至 0.0078%±0.0057%。這些研究結果都在四種 SARS-CoV-2 的變異株（β .1.3 、β .1.1.7 、β .1.351 和β .1.1.248 ）中得到證實。同時使用這兩種藥物都可將人類男性和女性 iPS 中的病毒載量降低到 0.01% 以下。這些發現表明，對于 TMPRSS2 和 CTSB 的靶向化合物表現出高效的抗病毒效果，這可以為 COVID-19 的治療藥物研發提供一種思路。
為了闡明除ACE2以外的受體和蛋白酶在SARS-CoV-2感染中的功能，該研究通過使用過表達ACE2的iPS（ACE2 iPS）和CRISPRi系統抑制了BSG、CTSB和TMPRSS2基因的表達水平，并設計了針對這些基因的sgRNA 。用表達sgRNAs、mKate2和抗病毒基因的質粒電轉染iPS ，如下圖所示。

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在比較通過 dCas9 蛋白表達抑制 ACE2 的 iPS 中目標基因的表達水平后，對細胞進行 SARS-CoV-2 感染，如下圖所示。

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結果發現CTSL、CTSB和TMPRSS2的抑制使得ACE2 iPS中的病毒RNA拷貝數分別降低至11.7%±3.77%、0.84%±0.062%和20.6%±10.4% 。 TMRPSS2的抑制始終減少了刺突（S）蛋白的ACE2 iPS的數量。這些結果表明， CTSB、CTSL和TMPRSS2參與了ACE2 iPS的SARS-CoV-2感染。
基于上述發現，該研究團隊接下來探究了CTSB、CTSL和TMPRSS2抑制劑是否能抑制ACE2 iPS中的SARS-CoV-2感染。用SARS-CoV-2感染表達ACE2的iPS后，細胞在CA-074甲酯（CA-074 Me ， CTSB抑制劑）、Z-Phe-Tyr（tBu）-重氮乙基酮（CTSL抑制劑）、卡莫司他（TMPRSS2抑制劑）或納法莫司他（TMPRSS2抑制劑）的存在下培養，如下圖所示。

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結果發現在表達 ACE2 的 WTB CRISPRi Gen1 細胞中，經 CA-074 Me 處理后，病毒 RNA 的拷貝數減少至 0.62%±0.25%。在表達 ACE2 的 1383D6 細胞中，通過 Camostat 和 Nafamostat 處理，病毒 RNA 拷貝數分別減少至 0.48%±0.023% 和 0.23%±0.14%。在這四種化合物中，Nafamostat 對 ACE2 iPS 具有細胞毒性。這些結果表明，CA-074 Me 或 Camostat 治療可降低 ACE2 iPS 中 SARS-CoV-2 的感染效率。