【文獻解讀】源井CRISPR-B技術助力解密沙門氏菌與Fe的愛恨情仇( 二 ) _健康小知識

為進一步研究Fur被UMP化后的功能，作者分析了UMP化的H33和H118位點的空間結構， H33位于Fe結合位點附近， H118位于Fur同源二聚體的表面。通過序列比對發現， UMP化的殘基（H33和H118）在Fur的直系同源物中高度保守，表明YdiU介導的UMP化對Fur的調節被廣泛采用。通過建立H118A突變體（由廣州源井生物構建），發現Fur不能被YdiUUMP化，從而證明H118是Fur的主要UMP化位點。為了進一步研究UMP化對Fur特性的影響，作者使用體積排除色譜法分析了YdiU敲除的Fur（FurdYdiU）和YdiU表達的Fur（FurpYdiU），兩者不同的洗脫峰說明YdiU介導UMP化后， Fur的聚集狀態發生了改變。隨后用天然凝膠法和動態光散射法（DLS），對沙門氏菌內源Fur與體外UMP化的Fur（FurUMP）進行了比較，與內源Fur相比， FurUMP的條帶發生了偏移。總體結果表明Fur經過UMP化后，穩定性更低且更易聚集。隨后又通過凝膠遷移實驗（EMSA）驗證了YdiU通過使FurUMP化影響Fur的DNA結合活性。
最終根據研究結果，作者提出了以下機械模型（圖3）：當沙門氏菌在富鐵環境中生長時， Fur蛋白與鐵攝取基因的啟動子區結合，抑制RNA聚合酶的招募并減少鐵的吸收；當沙門氏菌進入宿主細胞時，缺鐵、高活性氧和低pH均會激活YdiU蛋白的表達；然后YdiU通過UTP將一個UMP基團轉移到Fur的H118位點，防止Fur的二聚化；Fur從鐵攝取基因的啟動子區被取代；通過這種機制，沙門氏菌獲得足夠的鐵在宿主細胞內生存。鑒定的修飾位點在同源蛋白中高度保守，表明Fur的這種調控機制普遍存在。 UMP到組氨酸的共價連接模式與磷酸化組氨酸（pHis）的共價連接模式相似，這在原核信號轉導中起關鍵作用。

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圖3沙門氏菌感染過程中YdiU介導的鐵攝取調節模型
【【文獻解讀】源井CRISPR-B技術助力解密沙門氏菌與Fe的愛恨情仇】UBIGENE在該研究中利用了獨家CRISPR-B?技術構建了沙門氏菌的H118A突變體，有效驗證了鐵穩態主要調節劑fur的主要UMP化位點。 CRISPR-B?技術是源井基于Red/ET重組系統和CRISPR/Cas9基因編輯系統，通過優化基因編輯載體和基因編輯流程，在基因編輯效率和準確性均遠高于傳統方法的一項創新性技術。該技術可實現大腸桿菌/沙門氏菌/銅綠假單胞菌的無痕基因編輯，且應用范圍廣泛，包括基因敲除，基因點突變和基因敲入；返回搜狐，查看更多
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