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肝素|MP 淋巴細胞分離液使用說明書

LSM 淋巴細胞分離液
用途：
用于體外分離外周淋巴血細胞
方法概述： 分離混合血液白細胞早期的方法 ， 總是伴隨紅細胞聚集 ， 只輕微影響白細胞 。 通過離心 ， 紅細胞密度增加聚集 ， 同時可以從離心管上部收集白細胞 。
B?yum提出了一種更方便 ， 通過使用Ficoll? 甲泛影鈉溶液離心快速分離方法 。 稀釋的血液在Ficoll?甲泛影鈉溶液中分層 ， 低速短時離心 。 紅細胞和沉降到管底的粒細胞 ， 和單個核細胞（淋巴細胞）和血小板可以從兩個分層之間收集 。
許多研究者不斷努力 ， 修訂了B?yum方法 ， MP生物醫學公司生產的LSM ， 方法的獨特之處是運用,泛影鈉成功的代替了甲泛影鈉 。
程序原理： 除去血液中的纖維蛋白或肝素處理血液以1：1的比例用生理鹽水或平衡鹽溶液稀釋 ， 在分離溶液中分層 ， 低速離心30分鐘 。 通過離心 ， 遷移能力不同最終形成不同的細胞層 。
大部分的紅細胞和粒細胞通過梯度遷移形成顆粒狀 。 由于其密度不同 ， 淋巴細胞和其他單個核細胞（單核細胞和血小板）分布在在血漿和LSM兩層中間 。 淋巴細胞可以通過回抽分層回收 ， 在進一步去除血小板 ， LSM和血漿 。
試劑： LSM? is a sterile filtered solution which contains 6.2g Ficoll and 9.4 g sodium diatrizoate per 100 ml. The density is 1.0770-1.0800 g/ml at 200C.
LSM? 是一種滅菌過濾溶液 ， 每100毫升包含6.2克聚蔗糖和9.4克鈉胺 。 密度是1.0770-1.0800克/毫升20℃ 。
使用說明： 以下的操作步驟是最初由B?yum.設計的程序的眾多改良版本中的一種 。 此程序的改良是通過運用除去血液中的纖維蛋白或抗凝血劑處理人體血液；這種改良對于其他物種來源血液或者其他組織非常有必要 。
1. 輕輕顛倒瓶子使LSM充分混合

肝素|MP 淋巴細胞分離液使用說明書
文章圖片

2. 無菌轉移3 mlLSM到15 ml離心管中 。
3. 混合2 ml除纖維蛋白血液或肝素處理血液 和2 ml 生理鹽水
4. 仔細的將稀釋血液加入3 mlLSM（室溫）于15ml離心管中 ， 在血液和LSM中形成一個明顯的分層 。 不要將稀釋血液混合入LSM中 。
5. 室溫下400g離心15-30分鐘 ， 離心可以沉淀紅細胞和多核白細胞同時可以再LSM上形成一層單核淋巴細胞 ， 如上圖所示 。
6. 吸出淋巴細胞上方2-3mm的血漿 。
【肝素|MP 淋巴細胞分離液使用說明書】7. 吸取淋巴細胞層以及它下面一半的LSM和轉移到另外的一個離心管 。 加入等體積的平衡鹽緩沖液至淋巴細胞離心管中 ， 室溫離心10分鐘 ， 離心速度設定在既不損傷細胞又能沉淀細胞即刻 ， 例如160 - 260 x g（去除LSM和降低血小板的百分比） 。
8. 用平衡鹽緩沖液清洗細胞 ， 用適當的培養基重懸細胞 。
實驗步驟
1. 新鮮血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（無血清）培養液或PBS按照1：1 稀釋；
2.在15ml或50ml塑料離心管中預先加入淋巴細胞分離液 ， 使分離液：稀釋后血液=1:1；
3.小心的將稀釋后的血液加到分離液的上面；
4.室溫 2600rpm 離心20分鐘；
5. 取出離心管 ， 小心吸出白白的那一層 ， 重懸于5倍體積的不完全培養液或PBS中 ， 混勻；
6.室溫 1500rpm 離心5分鐘；
7.吸棄上清 ， 再加4ml不完全培養液 ， 混勻；
8.室溫 1000rpm離心5分鐘；
9.棄上清 ， 用完全培養液稀釋至2ml；
10.淋巴細胞記數；
11.按所需濃度及實驗目的稀釋細胞 ， 種板 。
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分離外周血中的單個核細胞