《自然》：抗癌能用的新抗原，比我們想的多多了！( 二 ) _健康小知識

于是，根據免疫肽組的時序變化， Jacks團隊進一步分析了腫瘤進展對免疫肽組的影響及其相關的生物學特征。在KP模型中，他們觀察到了多肽特征的動態變化，且腫瘤晚期特征與胃上皮模塊、高度混合轉錄基因模塊的相關性增加（圖4g-h）。
GSEA分析表明，晚期腫瘤多肽特征與炎癥細胞因子信號通路正相關，與Myc信號通路、代謝過程和上皮-間充質轉化（EMT）負相關（圖4i）。此外，他們還關注了KP腫瘤細胞的轉移簇特征，說明了MHC-I呈遞存在顯著的腫瘤內和腫瘤間異質性（圖4j-k）。

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圖4LUAD免疫肽組在整個腫瘤進化過程中是動態的和異質的
前面的探索雖然闡明了來自KP腫瘤的廣泛免疫肽組特征，但并未說明與健康的肺或正常AT2細胞相比， KP腫瘤中特異的肽的特征（圖5a）。因此，為了了解轉錄過程和LUAD特異性肽呈遞之間的關系，他們將LUAD進展過程中編碼LUAD特異性肽的基因的相對mRNA表達水平，與正常AT2細胞中的進行比較，發現LUAD特異性肽的呈遞效率與平均mRNA表達水平或預測的肽親和力均無關（圖5b）。
這也就意味著， mRNA表達的變化不能完全解釋單個肽的LUAD特異性呈遞效率。 Jacks團隊通過對腫瘤進展任何階段都上調的基因進行鑒定，及對其相應多肽的親和力進行預測，最終只有39個為LUAD特異性肽，這也證明了以往使用RNA表達水平或親和力預測等方法篩選腫瘤特異性抗原肽的局限性（圖5c）。
相應地， Jacks團隊還評估了腫瘤細胞或正常細胞中的蛋白質合成是否可以更好地預測LUAD特異性肽的呈遞。他們獲得了正常AT2細胞和KPLUAD細胞的類器官培養物，并在體外進行了核糖體分析（Ribo-seq）和轉錄組測序（RNA-seq）。分析結果表明，與這兩種類器官各自特征相關的基因均表現出更高的翻譯率（圖5d-e）。
【《自然》：抗癌能用的新抗原，比我們想的多多了！】綜合分析Ribo-seq、RNA-seq數據后， Jacks團隊發現，有些基因在兩種類器官之間有明顯的mRNA或RPF（RibosomeProtectedFragment）豐度差異，但編碼LUAD特異性肽的基因卻通常沒有差異，且通過TE（TranslationEfficiency）預測所得的肽與LUAD特異性肽的重復率非常低（圖5f-g），這也就是說，通過蛋白質合成也不能很好地預測腫瘤特異性抗原肽。

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圖5LUAD特異性多肽的轉錄和翻譯
最后， Jacks團隊在KP/KbStrep模型中發現了135個推測的非突變腫瘤特異性抗原（TSAs）和147個推測的腫瘤相關抗原（TAAs）（圖6a）。
為了驗證這兩類抗原的免疫原性，他們用一種混合肽樹突狀細胞（DC）疫苗（3種TSAs ， 5種TAAs）接種小鼠，并使用ELISpot技術檢測IFN-γ的分泌（代表著T細胞的應答水平，側面反映抗原的免疫原性）；最終他們發現了三種免疫原性肽，其中兩種是無法在體外篩選到的，且難以通過RNA或RPF的表達進行預測（圖6b-d）。
進一步，他們利用tetramer技術對接種了5周疫苗的KP荷瘤小鼠的CD8+T細胞反應性進行評估（圖6e-f），證明了被激活的T細胞確實能識別特定序列的腫瘤抗原肽。對其余五個缺乏免疫原性的多肽，他們也進行了分析，這些多肽在健康小鼠中被發現主要集中于AT2細胞，而在廣泛的肺組織中則表達很低，從而導致了錯誤的推測（圖6g）。
以上分析也表明，與體外或芯片篩選方法相比，體內的細胞特異性免疫肽組學提供了通過經驗評估細胞特異性和組織特異性呈遞模式的機會，并能更準確地分類潛在抗原（圖6h）。