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【康日百奧業務181-1849-0181】理化屬性表征

健康知識養生常識

理化屬性表征
01抗體藥物結構
抗體藥物結構表征主要包括以下參數：
1)完整分子量
2)輕鏈分子量
3)重鏈分子量
4)氨基酸序列
5)二硫鍵
6)自由巰基
7)糖基化位點
8)N-端測序
9)翻譯后修飾
10)二、三級結構表征
在前9項一級結構表征中 ， LC/MS是最主要和最基礎的表征方法 ， 二三級結構涉及使用圓二色譜 ， 紅外光譜等 ， 細節不作贅述 。
抗體結構表征的目的 ， 除了全面表征抗體藥物質量 ， 另外一個核心目標是尋找可能影響抗體藥物療效的關鍵氨基酸殘基、關鍵氨基酸的翻譯后修飾 ， 進行相關工藝改造和確認 ， 避免在工藝開發后期以及臨床階段 ， 產生不良影響 ， 也是本文主要的討論內容 ， 主要包括：脫酰胺 ， 異構化 ， Met和Trp氧化 ， 未配對的半胱氨酸等 。
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1.1脫酰胺
天冬酰胺（Asn） ， 尤其是CDR區的Asn殘基脫酰胺 ， 是單克隆抗體藥物最常遇到的降解途徑之一 。 當Asn后面是小的且活躍的甘氨酸（Gly）殘基（NG基序）時 ， 容易發生脫酰胺 ， 并且如果發生在CDR區 ， 會導致對抗原結合親和力降低 ， 抗體效力喪失 。 因而在抗體測序和生物信息學評估時 ， 需要關注CDR區的Asn-Gly殘基 ， 并在強制降解階段對其進行評估 。
此外在IgG的Fc段“PENNY”環肽中 ， 也包含脫酰胺易感位點 ， 但是因為通常不會對抗體藥物結合抗原帶來負面影響 ， 一般不做重點關注 。
1.2氨基酸氧化
蛋氨酸（Met）和色氨酸（Trp）殘基容易發生氧化 。 其中重鏈CDR2中的蛋氨酸以及Fc區中的蛋氨酸氧化并不會影響抗原結合 。 但是當氧化水平較高 ， 或者發生在抗原結合的關鍵CDR區域 ， 會降低抗原結合能力 ， 降低抗體藥物的有效性 。
靠近CH2-CH3區域的蛋氨酸殘基易發生氧化 ， 導致熱穩定性下降 ， 聚集增加 ， 補體依賴性細胞毒性（CDC）下降 ， 與FcRn的結合親和力下降以及體內半衰期縮短 。
CDR中Trp殘基的氧化 ， 可能導致有效性降低 ， 熱穩定性降低和聚集傾向增加 。
總體而言 ， 生物信息學分析和一級序列測定時 ， 應重點關注CDR區Met和Trp的氧化 ， 并確定它們的敏感性 ， 必要時在工藝階段采取適度控制策略 。
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1.3Asp異構化
Asp異構化是單克隆抗體藥物的另一種降解途徑 。 CDR區的Asp殘基 ， 如果后面是Gly殘基 ， His或Ser時 ， 通常易于異構化 。 CDR區發生異構化 ， 可能導致抗原結合親和力降低 。 當pH值在5左右時 ， 有利于Asp異構化 ， 因此抗體藥物的制劑配方開發時 ， 需要注意其pH值盡可能避開5 。
1.4糖基化位點
IgGCH2Asn-297連接的N糖為核心7糖結構 ， 四個N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和三個甘露糖(Mannose)殘基 。 根據抗體的功能需要 ， 會對抗體的糖型進行改造 ， 以獲取相應的功能特性 ， 以及延長或縮短抗體半衰期等 。 因而糖基位點檢測分析貫穿于抗體藥物工藝的整個過程 ， 也是質量放行的關鍵質量屬性 。
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▲Biologicals(2017)
抗體糖工程改造主要有巖藻糖基化 ， 乙酰葡糖胺化 ， 半乳糖基化 ， 唾液酸化四種 。
通過核心巖藻糖基轉移酶(Fut8)催化N-聚糖GlcNAc核心巖藻糖基化；通過乙酰葡糖胺基轉移酶3(GNT3)在分支角Mannose上添加乙酰葡糖胺（GlcNAc）；通過β-1,4-半乳糖轉移酶1(b4GALT1)在七糖末端的兩個GlcNAc添加半乳糖 ， 使其半乳糖化 。 這三種策略是改變和1型FcγR的結合 。 在核心巖藻糖基化以及半乳糖基化的基礎上 ， 在α2,6-唾液酸轉移酶（ST6GAL1) ， 可以增加抗體的唾液酸化 ， 唾液酸化則可以增加和2型FcγR的結合 。