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PDX模型聯合CRISPR/Cas9篩選兒童急淋化療耐藥治療靶點( 二 )

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研究團隊比較了小鼠骨髓中腫瘤細胞數量與活體成像的結果 ， 發現從小鼠骨髓的腫瘤細胞數量與成像結果密切相關 ， 說明通過生物發光成像結果可判斷腫瘤負荷(下圖E,F) 。 接著 ， 通過成像值對治療反應進行如下分組：未處理組(U;治療起始點) ， 敏感組(S;治療開始后2-3周) ， 持續組(P;相對于治療開始和穩定的腫瘤負荷 ， 成像值低于1%)和耐藥組(R;與持續組相比 ， 成像值至少增加了10倍(下圖D) 。 即便在低劑量藥物作用下 ， 腫瘤獲得性耐藥再次發生(下圖G) 。
為了探究不同患者腫瘤中是否存在相同的獲得性耐藥模式 ， 研究團隊構建體內多重PDX模型方法評估同一動物體內的治療反應 。 通過將用不同熒光素標記來自不同患者的PDX腫瘤細胞 ， 混合后注射到同一組小鼠體內(下圖H) 。 流式檢測每個PDX模型細胞的生長曲線和治療反應(下圖I) 。 其中ALL-502表現出天然耐藥 ， 而ALL-50和ALL-265呈現對治療反應敏感 ， 可進一步構建耐藥模型(下圖I) 。 為了使腫瘤縮小較為顯著（兩個數量級差異） ， 兩PDX模型在給藥時間和給藥途徑保持不變時 ， 增加藥物劑量并成功建立ALL-50及其6個（D1-D6）耐藥株模型(下圖J) 。 在不同患者的PDX模型、小鼠重復和不同劑量化療藥物組合中 ， 體內長期化療導致的獲得性耐藥均呈現出三個階段發展模式：初期敏感-中期持續緩解-后期增殖 。
PDX模型聯合CRISPR/Cas9篩選兒童急淋化療耐藥治療靶點
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ALL-PDX獲得性耐藥體內模型 ， ALL-199PDX在體內長期治療后獲得耐藥性 。 A.實驗流程圖B.利用植入的PDX細胞帶有熒光素酶進行活體成像對小鼠模型長期監測疾病進展和治療效果 。 C.不同PDX重復及單藥或聯合用藥的腫瘤生長情況 。 D.流式檢測四種類型 ， 未處理U,敏感S,持續P,耐藥R組的腫瘤細胞數量 ， 綠色熒光eGFP代表腫瘤細胞 。 E.四個類型分組小鼠模型骨髓里腫瘤細胞百分比 。 F.代表腫瘤負荷的活體成像生物熒光強度與腫瘤細胞占小鼠模型骨髓中的比例有很好的相關性 。 G.活體成像監測低劑量化療方案處理ALL-199PDX模型時腫瘤細胞生長情況 。 H.體內多重PDX模型方法評估同一動物體內的治療反應 。 I.流式檢測經過治療后各種不同來源的PDX細胞數量 。 J.ALL-50PDX模型在長期單藥或聯合用藥情況下腫瘤細胞生長情況 ， 與ALL-199類似
為了進一步研究耐藥表型特點 ， 研究團隊用聯合化療方案重新作用于取自不同耐藥階段的四組PDX細胞(下圖A) 。 PDX細胞重新移植到次級受體小鼠時 ， 敏感組(下圖B)和持續組(下圖C)腫瘤細胞生長速率與對照組細胞(即各自未經藥物處理PDX細胞)相比并無差異 。 敏感組細胞和持續組細胞與其各自未處理的對照組細胞對藥物治療反應相似 ， ALL-199R耐藥細胞增殖速度則明顯較慢(下圖D) ， 表明耐藥的出現伴隨著增殖適應度下降 。
此外 ， 研究團隊將ALL-199的8個耐藥PDX模型細胞進行停藥半年后再次給予原化療方案治療 ， 發現大部分耐藥表型仍保持穩定耐藥狀態（除D4 ， 下圖E）,并且大部分耐藥細胞可耐受高劑量化療（下圖F） 。 PDX模型在連續給藥情況下均在小鼠體內增殖 ， 耐藥表型在重新植入新的小鼠體內依然保持 ， 表明ALL-PDX獲得的耐藥性是穩定的 。
ALL-PDX獲得的耐藥性是穩定的 ， 耐藥表型在重新植入新的小鼠體內依然保持 。 A.實驗流程圖：將四種不同階段的PDX細胞分離后重新植入次級受體小鼠體內增殖30-40天后再給與原先相同的長期治療方案 。 期間監測腫瘤生長情況和治療反應 。 B、C、D.重新植入小鼠體內的不同階段的PDX細胞的增殖情況和治療反應 。 E.半年停藥期 ， 耐藥表型仍穩定 。 F.大部分耐藥細胞可耐受高劑量化療 。