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PDX模型聯合CRISPR/Cas9篩選兒童急淋化療耐藥治療靶點

健康知識養生常識

撰文|吳培煌責編|周葉斌
獲得性耐藥是一個目前尚未解決的臨床挑戰 ， 也是癌癥患者獲得治愈的主要障礙 。 盡管化療在臨床上治療腫瘤已幾十年 ， 但其獲得性耐藥的確切機制仍不充分 ， 阻礙了有效的干預 。 人們做了大量的工作來確定獲得性耐藥性的機制 ， 包括對臨床樣本測序確定耐藥相關突變和表達譜 ， 單細胞測序揭示腫瘤的異質性和克隆進化 ， 但由于技術上困難 ， 迄今為止 ， 獲得性耐聯合化療的體內研究較少 。
PDX模型是一種將腫瘤患者的腫瘤組織移植至免疫缺陷型小鼠體內 ， 并使腫瘤組織在小鼠體內生長而構建成的一種腫瘤模型 ， 已經被用于研究多種藥物和實體腫瘤耐藥性 ， 被認為是目前可用的與患者最相關的臨床前模型系統 。
2022年12月 ， 由來自德國和奧地利的多單位聯合研究團隊 ， 在Leukemia上發表了題為InvivoPDXCRISPR/Cas9screensrevealmutualtherapeutictargetstoovercomeheterogeneousacquiredchemo-resistance的文章 。 為了尋找研究和克服獲得性化療耐藥 ， 最大程度模擬臨床情況 ， 該研究團隊成功建立一個類似于臨床過程的獲得性耐藥模型用于深入研究耐藥機制 。 他們選用來源于急性淋巴白血病患兒患者腫瘤細胞的異種移植(PDX)模型 ， 整合表型和體內藥物反應預測患者的臨床病程 ， 并對模型進行長期體內聯合化療并結合復雜的基因編輯技術篩選耐藥基因 。 同時 ， 研究團隊通過對耐藥模型的基因組測序 ， 發現長期化療誘導了腫瘤細胞廣泛的基因組改變 ， 而進一步體內功能基因組篩選發現BCL2、BRIP1和COPS2等治療靶點 ， 即便相同來源的耐藥株存在異質性 ， 但因存在共同表達譜特征可通過抑制單一靶點克服耐藥性 。
研究團隊首先成功建立一個模擬臨床治療過程的ALL-PDX獲得性耐藥體內模型 。 研究者首先從急性淋巴細胞白血病患兒體內獲取白血病細胞 ， 進行熒光素酶示蹤標記 ， 并將標記好的白血病細胞植入小鼠體內 ， 為模擬臨床獲得性耐藥的過程 ， 他們采用目前臨床上廣泛使用的細胞毒性藥物（化療藥物）連續18周作用于ALL-PDX模型小鼠 ， 活體成像來動態觀測小鼠模型體內患者腫瘤細胞生長狀況及其對藥物的治療反應 ， 并在此基礎上設計和篩選出多藥聯合耐藥的治療靶點 。 利用體內CRISPR-Cas9篩選技術敲除基因及通過靶點的抑制劑來驗證 。
PDX模型聯合CRISPR/Cas9篩選兒童急淋化療耐藥治療靶點
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研究總體流程圖：上.從急性淋巴細胞白血病患兒體內取得腫瘤細胞 ， 植入NGS小鼠體內構建PDX模型 ， 并模擬臨床的多化療藥物聯合方案給小鼠模型進行長達4個月的用藥 ， 期間監測腫瘤生長情況 ， 最終獲得耐藥株；中.對構建的耐藥株進行基因組測序 ， 盡管來源同個患者的耐藥株存在異質性 ， 但有共同的基因表達譜；下.采用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除耐藥株共同表達的基因進行功能基因篩選并對靶點進行驗證
研究團隊采用環磷酰胺(Cyclo)和長春新堿(VCR)的兩藥組合方案對PDX小鼠模型進行長達18周的治療(下圖A) ， 小鼠腫瘤負荷能有效降低兩個數量級以上并呈現良好的耐受性 。 模型動物在腫瘤高負荷下開始治療 ， 單藥對腫瘤進展的影響很小 ， 但在治療開始后的4周內 ， 聯合用藥使腫瘤負荷降低了兩個數量級 ， 表明細胞最初對治療很敏感(下圖C) 。 此后 ， 腫瘤在治療下持續數周治療下無增殖現象 ， 類似于最小殘留病變(MRD)階段和耐藥狀態（稱為Persist） 。 最終 ， 耐藥細胞都恢復了生長(下圖B,C) 。 8只小鼠重復模型均表現出相似的獲得耐藥動力學 ， 表明模型的一致性較好 ， 因腫瘤均來自同一患者標注為D1-D8 。