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PDX模型聯合CRISPR/Cas9篩選兒童急淋化療耐藥治療靶點( 三 )

健康知識養生常識


研究團隊發現獲得性耐藥是一種穩定的特征 ， 推斷基因組改變可能是耐藥表型的基礎 ， 于是他們對ALL-199來源的樣本（種系對照） ， 包括患者健康的骨髓細胞、ALL-199供體PDX模型 ， 未處理PDX細胞及ALL-199來源的耐藥株D1-D8進行全外顯子測序來比對體細胞改變與耐藥相關改變 。 對照組PDX模型中檢測到染色體1、6、7、9、13、14、17和19上的體細胞拷貝數改變(CNA) ， D1-D8耐藥株染色體上出現了1,6,17和X拷貝 ， 它們大多是以單獨的組合出現（下圖C） ， 包括染色體短臂的部分缺失 。 值得注意的是 ， 在供體樣本中17q擴增 ， 位于17p上的基因有兩個拷貝 ， 而在未處理的樣本中 ， 17q上的基因有三個拷貝 。 同樣的染色體改變也在其他來源模型中出現 ， 說明經過長期化療 ， 耐藥株存在明顯的單一克隆并具有異質性 。
接著 ， 研究團隊詳細分析了ALL-199耐藥株位于1號和17號染色體上常見單核苷酸多態性(SNP)的變異等位基因頻率(VAFs) 。 耐藥株D4-D8中 ， 觀察到反復的1p缺失 ， 1p36基因的下調可能有助于耐藥性的形成 。 有趣的是 ， ALL-50耐藥株中都發現反復突變的RPL22正好位于1p36上 ， 表明1p36基因在兩種PDX耐藥發展中都發揮了重要作用 。 D1和D2缺失17號染色體不同的等位基因（下圖E/F） ， 腫瘤抑制因子TP53位于17號染色體的短臂上 ， 耐藥株D1和D2在VAFs分別為95%和82%時 ， 在TP53的單個等位基因上分別攜帶了不同的突變 ， p53功能喪失可能有助于亞克隆的耐藥 。 總而言之 ， 耐藥株之間存在異質性克隆 ， 不同耐藥株間都有明顯的染色體和基因組改變 。
為了探討不同的基因組改變是否存在共同表達譜特征 ， 研究團隊對未處理、敏感組、持續組和耐藥細胞的轉錄組及蛋白質組學進行分析(下圖G) ， 在耐藥組和未處理組細胞中 ， 共有525個基因顯著下調 ， 其中273個基因顯著上調 ， 252個基因顯著下調(下圖G、H)；蛋白質組學171個顯著下調的蛋白質中 ， 85個蛋白質在耐藥株中顯著上調(下圖I/C);轉錄組及蛋白質組基因集富集分析表明耐藥株有細胞粘附、上皮-間充質轉化、p53通路或缺氧等富集 ， 但未達統計學差異 。
ALL-PDX獲得性耐藥模型基因組改變呈異質性 ， 但具有共同特征表達譜 。 A.實驗總體設計 。 ALL-199生殖系對照 ， 取自患者健康的骨髓細胞、ALL-199供體PDX模型 ， 未處理細胞及ALL-199來源的耐藥株D1-D8進行全外顯子測序比對體細胞改變與耐藥相關改變 。 B、C.供體ALL-199與耐藥細胞模型之間的基因組變化情況 。 D3因獲取細胞數不夠而數據剔除 。 D、E.對1號和17號染色體變異等位基因頻率進行分析 。 每個點代表以hg19為參考確定的SNV 。 水平虛線表示VAF=0.5 ， 垂直虛線表示著絲粒位置 。 F.染色體分布示意圖表示 。 供體PDXALL-199(淺灰色)中有17號等位基因 ， 其中一個等位基因為chr17q重復 ， 在耐藥株D1-D2中(紅色) ， 其中兩個完染色體有17號等位基因丟失 。
耐藥株共同存在失調控基因和蛋白 ， 反映了在異質基因組變化背景下的相互耐藥表型 。 異質性耐藥株間共同基因表達譜特征變化 ， 可能是克服聯合化療獲得性耐藥性的治療機會 。 研究團隊采用CRISPR/Cas9慢病毒轉導敲除功能基因篩選技術對PDX模型進行體內篩選 ， 在ALL-199轉錄組和/或蛋白質組上調的候選基因中篩選了223個蛋白質編碼基因1196個sgRNAs做后續驗證 。 分別獲取了移植前細胞（Input）、治療開始前（Treatmentstart）、未用藥（3周PBS處理）及用藥組樣本進行后續分析 。 其中 ， 前三組中缺失的sgRNA認為是白血病細胞生長和生存所需的必需基因（下圖C）；僅在用藥組發現的缺失基因才認為是對治療敏感的基因(下圖C右) 。 在D7模型中 ， TBX21、BCL2、SCN1B、CSNK2A1和BRIP1基因完全缺失；COPS2基因在D7和D5兩個耐藥模型篩選中均消失(下圖D) ， 而這些基因在轉錄組RNA水平上(TBX21、SCN1B、CSNK2A1、BRIP1、COPS2)或蛋白質水平上(BCL2、COPS2)顯著上調 。