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骨關節炎|牛膝有效成分（ABE）干預BMSCs路徑治療骨關節炎獲得重大

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作者：馬篤軍課題組
廣州中醫藥大學第四臨床醫學院
骨性關節炎（OA）是中老年人常見的慢性關節疾病，涉及關節軟骨、滑膜、軟骨下骨等關節組織，主要表現為關節疼痛、僵硬及活動受限。OA的病因尚未明確，年齡、性別、肥胖、遺傳等是發病的高危因素。OA的治療目前市場上還沒有有效的手段。
馬篤軍課題組通過對既往治療OA文獻的數據挖掘和結合廣東省名中醫彭力平教授治療膝骨病的臨床經驗總結，發現懷牛膝是治療OA頻率最高的藥物，牛膝獨特的“標本兼治”和“引經”作用，使我們設想，牛膝的“強筋”功效，應包括對關節軟骨的防退變、促修復功能。牛膝的化學成分主要有多糖類、 皂苷類、甾酮類、 黃酮類及多種微量元素等，針對關節疾患的主要藥理作用包括抗炎鎮痛，還具有促進軟骨細胞增殖、促進骨髓干細胞歸巢、降低軟骨細胞凋亡率（通過影響 PI3K/AKT 通路）等作用?；谇捌谘芯?，馬篤軍課題組通過系列的分子生物實驗、組織工程實驗、動物實驗及臨床實驗反復的驗證，獲得了治療OA的重大突破。
懷牛膝：性味辛、苦，平。入肝、腎、膀胱經。具有活血化瘀，利關節，引血下行，補肝腎的功效。
一、基于CRISPR/Cas9技術探討牛膝有效成分促進BMSCs軟骨分化的網絡機制研究
以關節軟骨損傷為核心病理改變的骨關節炎疾病，自然修復軟骨組織缺乏正常力學性能，尚無理想藥物和療法修復軟骨，成為治療難點。骨髓間充質干細胞（BMSCs）能優于其他來源細胞分化為軟骨細胞，中藥干預下的干細胞軟骨分化具有特色和優勢，但促軟骨分化的研究較少。前期研究發現，牛膝含藥血清培養BMSCs能促使其明顯表達軟骨細胞標志性Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白，表明BMSCs向軟骨細胞分化，但作用機制不清楚。馬篤軍課題組通過兔BMSCs體外培養進行BMSCs和牛膝含藥血清與經典軟骨誘導劑對照培養，促使BMSCs體外誘導軟骨形成。采用蛋白組學iTRAQ技術、基因組高通量測序篩選牛膝誘導軟骨分化主要差異蛋白、基因及作用信號通路，用CRISPR/Cas9基因編輯技術編輯特異靶點RAB39B基因驗證結果，揭示牛膝對BMSCs體外擴增和軟骨細胞定向分化的機理。證實牛膝善“補肝腎、強筋骨”的中醫理論，為臨床解決關節軟骨損傷、退變的修復提供了理論依據（見圖1-7）。
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圖1 CRISPR/Cas9 的結構和作用機制圖
骨關節炎|牛膝有效成分（ABE）干預BMSCs路徑治療骨關節炎獲得重大
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圖2骨髓間充質干細胞培養及鑒定結果
骨關節炎|牛膝有效成分（ABE）干預BMSCs路徑治療骨關節炎獲得重大
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圖3 LentiCRISPRv2GFP 載體信息圖譜
圖4 RAB39B 敲除慢病毒感染兔骨髓間充質干細胞 (×100)
圖5 qRT-PCR 檢測 CRISPR/Cas9 系統基因敲除 RAB39B 后骨髓間充質干細胞中 COLⅡ、COLⅩmRNA 表達
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圖6 Western blot 檢測 CRISPR/Cas9 系統基因敲除 RAB39B后骨髓間充質干細胞軟骨分化相關通路 RHOA、 LIMK、 Sox9 蛋白表達變化
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圖7 基因編輯治療骨關節炎的路徑假想圖
二、牛膝有效成分干預BMSC-Exos對 OA模型兔局部骨組織超微結構及炎癥小體的影響
觀察牛膝醇提物含藥血清培養的骨髓間充質干細胞來源外泌體（BMSC-Exos）對實驗兔骨關節炎模型關節局部骨組織超微結構及炎癥小體的影響。