快報 | 乙酰磷酸（AcP）介導cAMP受體蛋白（CRP）的乙酰化調控分枝桿菌的毒力( 二 ) _健康小知識

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圖1K193位點乙酰化影響CRP的DNA結合能力(a)CRPK193位點突變蛋白的DNA結合能力。 (b)體外表達K193定點乙酰化蛋白（CRPK193Ace）。 (c)CRPK193Ace的DNA結合能力。
2.K193乙酰化修飾調控分枝桿菌CRP下游靶基因的轉錄：與MsmWT相比，模擬K193完全乙酰化的Msm-CRPK193Q染色體突變菌株導致CRP自身及其下游靶基因的轉錄明顯減少（減少30%~50%），而模擬完全去乙酰化狀態的Msm-CRPK193R菌株下游靶基因轉錄水平增加3~5倍（圖2）。結果進一步證實K193的乙酰化降低了CRP結合靶DNA能力，且K193乙酰化狀態抑制靶基因的轉錄，而完全去乙酰化狀態可增強它們的轉錄。

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圖2CRPMsm(MSMEG_6189)及其靶基因在CRP突變菌株中的轉錄水平。 *：P<0.05 ， **：P<0.01 ， ***：P＜0.001 ， ****：P＜0.0001
3.K193的乙酰化修飾減弱分枝桿菌的生長和抗逆能力：與野生株相比， Msm-CRPK193Q和Msm-CRPK193R染色體突變株都延遲了Msm的生長，相比MsmWT38小時進入靜止期， Msm-CRPK193R和Msm-CRPK193Q分別在42和46小時后才進入靜止期（圖3a），說明CRPK193的完全（去）乙酰化狀態均不利于分枝桿菌的生長。 CRPK193不同乙酰化狀態同樣影響分枝桿菌的抗逆能力， Msm-CRPK193R菌株在不同壓力下的存活率均明顯高于MsmWT（大約0.5lgCFU）（圖3b-3g）。然而除H2O2（5mM）和SDS（0.05%）條件外， Msm-CRPK193Q的抗壓力能力顯著下降，在低pH條件下， Msm-CRPK193Q的存活細胞數從8.0lgCFU明顯下降到4.7lgCFU ，在缺氧條件下為4.1lgCFU ，熱處理后為6.2lgCFU（圖3d-g）。

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圖3K193的乙酰化修飾影響分枝桿菌的生長和抗逆能力(a)突變株在7H9-OADC培養基中的生長曲線。 (b-g)突變株在0.05%SDS(b)、5mMH2O2(c)、缺氧(d)、低pH3.5(e)和低pH4.5(f)、熱處理(g)等不同脅迫條件下的生存能力。 *：P<0.05 ， **：P<0.01 ， ***：P＜0.001 ， ****：P＜0.0001
4.cAMP及不同環境壓力調控分枝桿菌CRPK193的乙酰化修飾水平：分枝桿菌能否通過感知外界環境變化直接調控CRPK193可逆的乙酰化修飾進而影響CRP的活性？研究定制CRPMTBK193乙酰化的特異性抗體并檢測在不同壓力和cAMP條件下菌體CRPK193位點的乙酰化水平，發現Msm暴露在不同的壓力下導致CRP的表達增加， K193位點的乙酰化水平下降（圖4a）。隨cAMP濃度增高， K193的乙酰化減少，而CRP蛋白的表達增加（圖4b）。綜上表明，生理狀態下的CRPWT不會保持完全的（去）乙酰化，分枝桿菌可以感知cAMP的水平和不利的環境條件，通過CRPK193可逆的乙酰化修飾來動態地調節CRP的活性進而調控細菌自身的生存。

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圖4cAMP及不同環境壓力調控分枝桿菌CRPK193的乙酰化修飾水平(a)不同脅迫條件下CRP蛋白表達水平和K193乙酰化水平。 (b)不同濃度cAMP下CRP的表達及K193的乙酰化水平。
5.CRPK193的乙酰化修飾調控分枝桿菌的致病性和毒力：與野生型菌株相比， Msm-CRPK193R的侵襲率和細胞內存活率在感染后6~48小時內明顯增加。然而Msm-CRPK193Q在三個感染菌株中表現出最低的細胞內存活能力（圖5a）。感染C57BL/6小鼠發現，從感染后8小時到11天，完全去乙酰化狀態的Msm-CRPK193R菌株在感染小鼠肺部、脾臟和肝臟的細菌載量明顯高于野生型菌株，而感染完全乙酰化狀態的Msm-CRPK193Q菌株的小鼠肺部和脾臟細菌載量則顯著下降（圖5b-f）。同時與感染MsmWT的兩只小鼠在第5天和第8天死亡相比，感染Msm-CRPK193R的六只小鼠在25天的實驗結束時死亡，而感染Msm-CRPK193Q的小鼠在實驗過程中沒有死亡（圖5g）。與MsmWT和Msm-CRPK193Q感染的小鼠相比， Msm-CRPK193R感染的小鼠肺組織中的炎癥浸潤和肺泡壁損傷更為明顯（圖5h）。