快報 | 乙酰磷酸（AcP）介導cAMP受體蛋白（CRP）的乙酰化調控分枝桿菌的毒力 _健康小知識

作者：中國防癆雜志期刊社
作者：狄玉昌，徐思悅，遲明哲，胡酉煒，張瀟，王洪海，張文宏，張雪蓮
第一作者及單位：狄玉昌復旦大學遺傳工程國家重點實驗室/生命科學學院/上海市傳染病與生物安全應急響應重點實驗室/國家傳染病醫學中心
通信作者及單位：張雪蓮，張文宏復旦大學遺傳工程國家重點實驗室/生命科學學院/上海市傳染病與生物安全應急響應重點實驗室/國家傳染病醫學中心
研究背景
結核分枝桿菌（MTB）作為結核病的病原體，其巨噬細胞內“成功”生存，部分歸功于它對宿主的動態和惡劣微環境（如低pH、低營養和缺氧等）的感知及反應能力。其中利用環磷酸腺苷（cAMP）作為第二信使來感知和應對各種外部環境就是分枝桿菌應對宿主環境的重要機制之一， cAMP可通過結合并激活cAMP受體蛋白（CRP）來傳遞信號。 CRP被認為是一個參與MTB代謝、感受NO及毒力等相關至少約100個基因調節的全局調節子，然而以往研究主要集中在CRP蛋白對靶基因轉錄水平上的調控，分枝桿菌如何調控CRP自身活性并調控下游靶基因的分子基礎并不完全清楚。本文研究發現分枝桿菌通過代謝產物AcP調節CRP蛋白193位賴氨酸（K）的乙酰化修飾來調控CRP活性進而影響下游靶基因的轉錄并調控分枝桿菌毒力的機制。
研究方法
1.體外評價K193位點乙酰化修飾對MTBCRP結合DNA能力的影響
（1）構建并純化MTBCRPWT ， K193位點突變蛋白（CRPK193Q模擬乙酰化蛋白， CRPK193R模擬非乙酰化蛋白， CRPK193A無側鏈蛋白）及定點乙酰化修飾蛋白（CRPK193Ace）；（2）將可結合CRP蛋白的DNA探針進行生物素標記，利用凝膠遷移實驗(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)檢測CRPK193位點模擬（去）乙酰化及定點乙酰化修飾對其DNA結合能力的影響。
2.評價分枝桿菌菌體內K193位點（去）乙酰化修飾狀態對下游靶基因轉錄的調控作用、對分枝桿菌生長和應對不利環境能力的影響
（1）為探究乙酰化修飾對菌體內CRP功能的影響，構建了恥垢分枝桿菌（MSM）基因組CRP編碼基因K193位點定點突變菌株（Msm-CRPK193Q和Msm-CRPK193R）；（2）評價CRPK193（去）乙酰化修飾對其下游靶基因轉錄水平的影響；（3）評價CRPK193（去）乙酰化修飾對恥垢分枝桿菌生長的影響；（4）探究CRPK193（去）乙酰化修飾對細菌應對不利環境脅迫能力的影響。
3.評價K193位點（去）乙酰化修飾對分枝桿菌胞內生存和毒力影響
（1）評價CRPK193（去）乙酰化修飾不同狀態的菌株侵染巨噬細胞和胞內復制能力差異；（2）通過小鼠感染實驗評價CRPK193（去）乙酰化修飾不同狀態對分枝桿菌毒力的影響。
4.探究CRPK193位點可逆乙酰化修飾的調控機制
（1）構建海分枝桿菌及結核分枝桿菌影響AcP產生的敲除株(Mma-△ackA ， MTB-△ackA)和NAD+依賴去乙酰化酶編碼基因敲除株（△Rv1151c）；（2）菌體內、外評價CRPK193乙酰化和去乙酰化的調控機制。
研究結果
1.CRP的K193乙酰化修飾影響其DNA結合能力：相比野生蛋白， CRP蛋白K193位點突變為谷氨酰胺（CRPK193Q ，模擬乙酰化）完全喪失了其結合靶DNA的能力，然而突變為精氨酸（CRPK193R ，模擬非乙酰化）對其結合DNA能力并沒有明顯的影響（圖1a）。同時無側鏈丙氨酸突變蛋白（CRPK193A）結合DNA能力不變，提示賴氨酸側鏈對于CRP與DNA結合的能力不是必需的，支持K-to-R和K-to-Q突變體之間不同的結合能力是由于K193的類似于不同乙酰化狀態的不同電荷導致的。用N?-乙酰賴氨酸體外表達系統制備K193定點乙酰化蛋白（CRPK193Ace）（圖1b），進一步確認CRPK193Ace蛋白不能結合靶DNA（圖1c），確證了K193乙酰化修飾導致CRP結合靶DNA能力喪失。