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異氟醚通過激活PERK/eIF2α通路誘導神經元凋亡和ERS在PND中的作用機制

養生常識健康知識

作者：古麻今醉
董營1何二濤2師榮榮1
1定州市人民醫院麻醉科 ， 定州073000；2蘭州大學第二醫院麻醉科 ， 蘭州730000
國際麻醉學與復蘇雜志,2022,43(08):789-794.
DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20211116?00603
基金項目
河北省醫學科學研究重點課題計劃（20181474）
ORIGINALARTICLES
【論著】
本研究主要分析內質網應激（ERS）在圍手術期神經認知障礙（PND）中的作用并探討通過蛋白激酶樣內質網激酶（PERK）抑制劑GSK2606414阻斷ERS對老年PND大鼠模型神經功能的影響 。
1資料與方法
1.1分組、建模和干預方法
30只健康雄性SD大鼠 ， 按隨機數字表法分為3組（每組10只）：對照組、異氟醚組和PERK抑制劑組（GSK組） 。 異氟醚組和GSK組根據參考文獻建立PND模型 ， 方法如下：將大鼠禁食、禁飲8h后放置在60cm×30cm×25cm的透明麻醉箱內 ， 麻醉箱的一側通道連接麻醉機 ， 另一側通道連接氣體監測儀；調節異氟醚濃度至2% ， 氧流量3L/min ， 連續4h 。 對照組進行同樣的處理但不吸入異氟醚 。 GSK組根據參考文獻 ， 在吸入異氟醚6h前（麻醉前）使用PERK抑制劑GSK2606414進行灌胃（150mg/kg） ， 對照組給予等量生理鹽水灌胃 。
1.2水迷宮實驗檢測神經功能
所有大鼠吸入異氟醚4h后進行水迷宮實驗 。 通過檢測大鼠的逃避潛伏期、穿越平臺次數、目標象限停留時間評估大鼠神經功能（逃避潛伏期越長、穿越平臺次數越低、目標象限停留時間越短提示神經功能損傷越嚴重） 。
1.3TUNEL染色檢測海馬組織神經元細胞凋亡率
水迷宮實驗結束后 ， 腹腔注射戊巴比妥（2ml/kg ， 濃度20g/L）麻醉處死所有大鼠 。 每組選取3只取海馬組織 。 每個樣本隨機選擇5個于熒光顯微鏡下觀察（×100） ， 細胞核染色為藍色熒光 ， 呈黃綠色熒光的細胞記為凋亡細胞 ， 細胞凋亡率=（凋亡細胞/總細胞數）×100% 。
1.4Westernblot法檢測海馬組織真核翻譯起始因子2α（eIF2α）、PERK磷酸化水平及78kDa葡糖調節蛋白（GRP78）、C/EBP同源蛋白（CHOP）水平
每組另取4只大鼠取海馬組織 。 液氮下研磨海馬組織 ， 并用預冷的PBS洗滌 。 然后將樣品在冰冷的RIPA裂解緩沖液中裂解 ， 采用BCA試劑盒測定總蛋白含量 。 后將蛋白樣本與角質酶Ⅱ混合并進行電泳 。 用10％凝膠通過SDS?PAGE分離等量的總蛋白（120V下電泳90min） ， 然后轉移到PVDF膜上（50V ， 120min） ， 在含有5％脫脂牛奶的封閉溶液中封閉 。 然后將PDVF膜與一抗（1∶1000稀釋）在4℃孵育過夜 ， 加入1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶耦聯二抗在室溫下孵育1h 。 使用ECL試劑盒可視化蛋白條帶 ， 使用甘油醛?3?磷酸脫氫酶作為內參對蛋白條帶的灰度進行定量 。 以磷酸化PERK（p?PERK）/PERK、磷酸化eIF2α（p?eIF2α）/eIF2α表示PERK、eIF2α磷酸化水平 。
1.5免疫組化染色檢測海馬組織B淋巴細胞瘤?2（Bcl?2）及B淋巴細胞瘤?2?AssociatedX（Bax）水平
每組剩余3只大鼠取海馬組織 。 將固定的大鼠海馬組織樣本切成4μm的石蠟切片 ， 脫蠟后3％H2O2處理10min 。 洗滌后用0.01mol/L的檸檬酸緩沖液（pH6.0）進行熱介導的抗原修復 。 然后使用PBS洗滌2次加入10％山羊血清封閉30min ， 后與兔抗大鼠Bax抗體（1∶1000稀釋）、Bcl?2抗體（1∶1000稀釋）在4°C下過夜 。 與山羊二抗一起孵育后 ， 在室溫下放置2h 。 DAB染色后使用蘇木精復染 ， 檢測各組的光密度（D）反映染色強度（反映海馬組織Bax、Bcl?2水平） 。
2結果
2.1各組大鼠水迷宮實驗結果比較
異氟醚組逃避潛伏期長于GSK組及對照組（P<0.05） ， 穿越平臺次數、目標象限停留時間少于GSK組及對照組（P<0.05） 。 見表1 。