SHP2抑制劑研究中的藥效學生物標志物-磷酸化ERK1/2蛋白檢測( 二 ) _健康小知識

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圖2.處于臨床階段的SHP2別構抑制劑（注：圖片來自靶點社）
三、SHP2抑制劑研究中藥效學生物標志物-磷酸化ERK1/2蛋白檢測
由于SHP2抑制劑研究基本上集中在晚期實體瘤如非小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、食管鱗狀細胞癌、胃腸道間質瘤和結直腸癌，在這些實體瘤中如何去方便的并且能夠及時的監控SHP2抑制劑的藥效成為了一個難點，因為臨床上在不同的給藥時間點獲取新鮮的腫瘤組織是相對比較困難的，對于病人來頻繁手術或穿刺說也是比較痛苦的。因此，大家都建議采用間接的方法比如抽取人外周血并分離單個核細胞（PBMC），通過評價PBMC中ERK蛋白的磷酸化的藥效來間接評估SHP2抑制劑的效果。
由于實體瘤中，人外周血PBMC相對于癌組織來說屬于一個正常的組織，而正常的PBMC中的ERK的磷酸化水平是極低的，基本上低于目前的很多檢測手段所能達到的檢測限。因此，對于PBMC中ERK磷酸化的檢測需要外源性加入刺激劑，提高ERK磷酸化的本底水平，如果PBMC中存在ERK上游通路中的一些蛋白激酶抑制劑，就會對刺激后的信號產生抑制，通過比較給藥前后的信號值變化，來評估ERK磷酸化的抑制率，從而間接來評價藥物的藥效。
因此，篩選出能夠刺激ERK磷酸化信號值明顯升高并且對于SHP2抑制劑比較敏感的刺激劑至關重要。我們查閱了大量文獻，參考很多資料，篩選了幾種潛在的刺激劑（比如PKC激活劑PMA、集落刺激因子、生長因子等），最終找到了一種刺激劑和相應的刺激方法，能夠在一個較大的窗口內提升PBMC中ERK的磷酸化水平并且能夠很敏感的反映SHP2抑制劑對于磷酸化ERK的抑制效果。

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圖3.SHP2抑制劑無法抑制PMA引起的Erk1/2磷酸化（注：上圖圖源2014,JMC,DOI:10.1021/jm5006176；下圖來自邁杰醫學數據）
【SHP2抑制劑研究中的藥效學生物標志物-磷酸化ERK1/2蛋白檢測】PMA刺激劑雖然能夠刺激pERK信號值發生較大窗口改變，但是PMA刺激的pERK信號值不能被SHP2抑制劑抑制住，抑制率為0% 。 PMA激活pERK主要是通過激活細胞內的PKC ，進而直接導致ERK的磷酸化，該激活通路繞過了上游的SHP2的信號，因此SHP2抑制劑不能夠抑制PMA引起的ERK磷酸化。圖4中的1號和2號刺激劑雖然也是通過SHP2通路能引起下游ERK的磷酸化，但是刺激的信號值較弱。而3號刺激劑引起的信號值較高，并且刺激后的pERK信號值能夠被SHP2抑制劑抑制，抑制率能夠達到97% ，因此，經過反復實驗3號刺激劑刺激的pERK的信號值更高，是一個比較合適的刺激劑特別是在SHP2抑制劑研究中。

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圖4.SHP2抑制劑-TNO155對不同的刺激劑的響應程度（注：數據來自邁杰醫學）
我們找到了一種合適的刺激劑和相應的方法，通過檢測ERK蛋白的磷酸化水平變化，能夠有效的評價SHP2抑制劑的藥效。并解決了一個難點：即實體瘤中如何去方便并且能夠及時的監控SHP2抑制劑的藥效，因為臨床上在不同的給藥時間點獲取新鮮的腫瘤組織是相對比較困難的，對于病人來頻繁手術或穿刺說也是比較痛苦的。因此，我們采用間接的方法，通過評價PBMC中ERK蛋白的磷酸化的藥效來間接評估SHP2抑制劑的效果。
我們選取了一例健康志愿者的全血，分成許多組，加入不同濃度的SHP2抑制劑，模擬藥物進入人體血液，然后按照邁杰開發的方法進行pERK的檢測來評價SHP2抑制劑的效果。 pERK和TotalERK檢測結果顯示，刺激劑能夠明顯的刺激起來PBMC中的pERK信號值，達到了14倍。另外， SHP2抑制劑在全血中不同濃度下抑制刺激劑引起的pERK刺激信號值，隨著藥物濃度下降， pERK抑制率也呈下降趨勢。