小奕說藥 │ 產品和工藝開發生命周期中HCP分析方法開發策略( 二 ) _健康小知識

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圖2.USP<1132>哺乳動物HCP抗原制備的典型過程
3.2.3.HCP質量分析
在動物免疫前應對HCP質量進行分析：制備抗原的總量；免疫測定或質譜分析等方法確認HCP抗原無任何產品污染；通過1-D或2-D聚丙烯酰胺凝膠電泳確定存在盡可能多的HCP蛋白。
HCP抗原同時也作為標準品使用，因此還要確保：生產量應足夠大，以提供多年（通常為10-20年）庫存；抗原制備過程應詳細記錄，以便于后期再生產時的回溯；HCP抗原組成也應足夠全面，以耐受產品生命周期內的工藝制造變化；HCP標準品應進行穩定性監測，避免發生降解。
3.2.4.抗HCP抗體的制備
由于制備的抗HCP抗體使用期限可能較長（例如產品或平臺的預期生命周期較長），因此所制備的抗體應盡可能多。由于CHO為哺乳動物細胞，因此使用在系統發育樹上離哺乳動物更遠的物種（如雞）有助于產生針對哺乳動物保守蛋白的抗體，有助于提高抗體覆蓋率。在免疫接種之前，應確認動物是否對產品藥物存在預先免疫抗體，應排除反應陽性的動物。
每只動物可進行多次增強免疫，以產生高滴度、高親和力抗體。低分子量HCP抗原往往免疫原性差，也可單獨收集低分子量HCP抗原，然后實行不同的免疫策略以增強免疫效果。
在合并抗血清前應對每個個體的血清進行滴度或Westernblot分析，以篩選和去除低滴度、僅對部分HCP具有免疫反應以及非特異性結合的抗體。最終獲得的抗體庫也應證明HCP的覆蓋率與專屬性。

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圖3.USP<1132>不同純化方法的優缺點
#3.3HCP抗體的覆蓋率研究
覆蓋率評估方法有兩種：二維電泳結合蛋白質免疫印跡（2-DWesternblot）或免疫親和捕獲。 USP<1132>對抗體覆蓋率評估的2種方法進行了對比（圖4）。

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圖4.二維電泳結合蛋白質免疫印跡與免疫親和二維電泳方法比較
3.3.1.2-DWesternblot
使用兩塊同樣的膠對同一樣品進行二維電泳，其中一塊進行Westernblot顯色，另一塊用銀染/熒光染色；再用軟件匹配分析兩塊膠中的蛋白質點，計算覆蓋率水平（圖5）。該方法操作較為簡便，但是重復性差、數據比對分析困難；且方法中HCP處于變性條件下，與ELISA檢測中的HCP的天然狀態不同（圖6）。

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圖5.2-DWesternblot覆蓋率分析流程圖

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圖6.USP<1132>覆蓋率對比圖示
圖：CHOHCP的2-DSDS-PAGE熒光染料染
色
右圖：與左圖相同樣品的Westernblot分析
3.3.2.免疫親和二維電泳
免疫親和二維電泳是基于免疫層析柱和二維電泳的方法。首先將HCP抗體偶聯到層析填料上，然后上樣HCP樣品，過程中HCP抗體可捕獲識別的HCP ，而未識別的HCP則會流穿，最后洗脫富集HCP 。分別將捕獲前和捕獲后HCP進行二維電泳銀染分析，計算抗體的覆蓋率（圖7）。

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圖7.免疫親和二維電泳流程圖
3.3.3.免疫親和-液相質譜（LC-MS/MS）分析
在免疫親和的基礎上，也可使用LC-MS/MS進行覆蓋率分析，并且可以定量分析HCP 。 LC-MS/MS方法有幾個優點：
1.可以在產品開發的早期鑒定潛在的高風險HCP（圖8）；
2.可以確定單個HCP的相對水平。但由于最終產品中的單個HCP水平非常低，對此方法的靈敏度提出了非常高的挑戰。