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小奕說藥 │ 產品和工藝開發生命周期中HCP分析方法開發策略

健康知識養生常識

前言
生物制品中來自生產細胞系自身的蛋白成分被稱為宿主細胞蛋白(HostcellProtein ， HCP) 。 HCP組成復雜 ， 既包含細胞分泌蛋白 ， 也包括結構蛋白 。 由于種類繁多 ， 這些蛋白的理化性質 ， 如等電點、疏水性、相對分子質量等往往具有明顯差異 。 HCP可能影響產品使用的質量 ， 例如：可能會引起病人的免疫應答或過敏性反應；可以引發生物制品的聚集或片段化；促進聚山梨酯的降解 ， 產生含有降解產物的可見異物 。
因此生物制品中HCP殘留含量通常被認為是產品的關鍵質量屬性(CQA) ， 是工藝穩健性監測的重要評價指標 ， 也是產品的重要質控指標 。
法規
在美國、歐盟以及各國法規中 ， 均將HCP定義為工藝相關雜質 。 相關指南指出 ， 應通過使用適當的、受控的制造工藝將其水平降至最低 。 ICHQ6B指出 ， 生物制品制造商應評估可能存在的雜質 ， 并根據臨床前數據和臨床經驗制定雜質的質量標準 。 在最終產品的殘留量限值中 ， 中美的推薦限度值均在0.01%以下 。
HCPELISA分析方法
酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是各國藥典推薦的在生物制品中檢測殘留HCP的方法 ， 該方法具有操作簡便、快速、高通量等特點 。 在USP<1132>和EP<2.6.34>中 ， 從抗原抗體制備、方法開發、抗體表征和方法驗證等多方面對宿主細胞蛋白檢測方法進行了詳細的表述 。
#3.1開發周期
常見的HCPELISA分析方法開發計劃 ， 應根據項目所處的不同階段而定 。 在產品開發時選擇商品化HCP試劑盒 ， 該分析方法通常可使用至臨床二期（圖1A） 。 臨床三期及以后 ， 應優選平臺工藝HCP方法或上游工藝專屬HCP方法 。 如果希望將商業化試劑盒應用于臨床三期和上市后 ， 則應充分證明試劑盒中主要試劑（如標準品、抗體等）適用于本工藝的HCP檢測 。 考慮到試劑盒來自外部供應商 ， 生物制品生產方對其控制較少 ， 當關鍵試劑（如抗體）更換時 ， 應當證明更換前后的方法一致性 。
平臺工藝HCP方法是指使用公司特定的宿主細胞株 ， 按照上游平臺工藝生產的HCP標準品和對應抗體所開發的檢測方法 。 當一個項目在上游條件相似時可用相同方法進行HCP檢測 。 圖1B表明 ， 如果在產品開發時已有基于平臺工藝的HCP方法 ， 則此方法可用于產品開發的所有階段 。 如果細胞培養工藝與平臺工藝發生顯著變化 ， 并且可能引入顯著不同的HCP群體 ， 則在臨床三期/工藝驗證之前需要切換到專屬HCP方法 。
小奕說藥 │ 產品和工藝開發生命周期中HCP分析方法開發策略
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圖1.USP<1132>產品開發不同周期HCP分析方法的選擇策略
A：在產品開發時選擇商業化試劑盒
B：在產品開發時選擇平臺HCP分析方法
#3.2HCP抗原制備
3.2.1.空載細胞培養
使用空載質粒轉染的生產細胞系,在接近于生產工藝的細胞培養條件下生成HCP 。 通常使用細胞池而不是單克隆培養的好處是更多的變異性可以產生更多的HCP 。
由于細胞活率、代謝和密度的變化都可能改變抗原的HCP譜 ， 因此可以略微更改細胞培養來產生不同的HCP組合（例如 ， 允許發酵時間更長、人為改變培養條件及降低細胞存活率等） ， 以獲得更寬的HCP譜 。
HCP抗原可以從代表性的小規模、中試規?；蛏a規模中產生 。 中試或生產規?？梢宰詈玫啬M實際工藝 。 然而 ， 如果僅應用一次大規模生產 ， 可能無法反映細胞培養過程中的正常變化；相反 ， 可以合并幾個小規模生產 ， 以更好地反映細胞培養過程不同引起的變異性 。
3.2.2.HCP收獲
HCP抗原可以從細胞裂解物、HCCF或兩者的混合物中制備 ， 如圖2所示 。 如果抗原從HCCF制備 ， 則可以延遲收獲細胞 ， 以允許更多細胞裂解并釋放HCP ， 從而拓寬HCP譜 。 上游發酵工藝結束后 ， 對所得HCP抗原進行最小程度的處理 ， 以減少HCP的損失 。 通常選擇與實際下游生產工藝相同或相似的HCCF步驟去細胞碎片 ， 然后通過超濾/滲濾處理HCCF ， 置換緩沖液（例如PBS或HEPE）并濃縮 。 應盡量減少過濾濾膜對HCP的損失 ， 例如使用10kDa或更小分子量截留的濾膜 。