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小奕說藥 │ 產品和工藝開發生命周期中HCP分析方法開發策略( 三 )

健康知識養生常識


小奕說藥 │ 產品和工藝開發生命周期中HCP分析方法開發策略
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圖8.一些潛在的高風險HCP
HCPELISA分析方法驗證
由于HCP抗原和對應的抗體均有上千種 ， 且HCP種類和數量隨純化步驟而減少 ， 這對HCP免疫分析方法的驗證提出了挑戰 。 對于中間過程樣品的驗證 ， 重點是方法準確度（加標回收率）、稀釋線性和精密度 。 針對最終產品應從準確度、精密度、稀釋線性、專屬性、定量限等多方面進行考察 。 下面對ELISA方法驗證中需要有針對性考慮的問題進行討論 。
#4.1定量限
ELISA定量限往往能做到ng/mL水平 。 首先向連續稀釋的DS的溶液中添加10ng/mL的HCP標準品 。 加標回收率可設為70%-130%（定量限處的加標回收率可設為50%-200%） ， 計算滿足要求的DS最小的稀釋倍數 。 第二步 ， 在最小稀釋倍數下加不同濃度的HCP標準品 ， 回收率應為70%-130%（定量限處的加標回收率可設為50%-150%） ， 符合上述要求的最低濃度即為定量限 。 結果通常需滿足由不同人員、不同天開展的至少三次實驗均合格 。
#4.2樣本稀釋線性
在HCP免疫測定中 ， 由于包被在96孔板中的抗體數量一定 ， 部分HCP含量可能會超過HCP抗體的量 ， 在HCP抗體飽和的情況下 ， 數據會失真；且免洗ELISA檢測方法在高濃度HCP時 ， 會存在Hook效應 。 因此在反應中HCP的量應低于抗體的量 。 某些情況下 ， 方法靈敏度有限 ， 即使樣品連續稀釋到定量限時也未觀察到線性 。 在這種情況下 ， 應報告驗證范圍內的最高HCP值 。 稀釋結果的非線性并不罕見 ， 一般認為是抗體數量不足 ， 但也有其他潛在原因 ， 例如抗體與產品的反應或基質干擾、存在非特異性抗體以及產品中存在HCP聚集等 。
其他常用的HCP檢測、定量和表征分析方法
HCP可用多種方法進行檢測 。 除了最常見的ELISA外 ， 其他常用的電泳方法有1-DSDS-PAGE、2-DSDS-PAGE以及CE-SDS等；常用的免疫印跡方法有1-D/2-DWesternblot；色譜方法有反相色譜法和蛋白組學方法 。
隨著對產品中HCP種類的認識逐漸豐富 ， 可以進行特定的蛋白質風險評估 ， 并在必要時對特定HCP雜質進行檢測 。 例如 ， 開發定量HPLC-MS/MS方法 ， 對特定HCP的肽段進行定量分析 。
討論
由于HCP的異質性 ， 并非每種HCP在動物中都能產生抗體 ， 高免疫原性的HCP所產生的抗體較多 ， 通常在ELISA信號中占主導地位 ， 而低免疫原性的HCP沒有足夠的抗體來識別它們 。 因此HCP檢測讀數為所有HCP的“免疫加權” 。 盡管如此 ， ELISA法能夠測定最為廣譜的HCP ， 是行業內最常用的HCP檢測方法 。 作為補充 ， 傳統的HCP檢測方法（例如1-D/2-DSDS-PAGE）仍然是HCP表征的有用工具 。 由于HCP檢測的復雜性 ， 需要根據產品生命周期選擇合適的檢測方法 ， 開發者應進行充足的表征研究 ， 進行必要的方法驗證 ， 滿足監管方要求 ， 確?；颊叩陌踩?。
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