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Hydromer親水涂層具有降低血栓形成性、細胞增殖和蛋白質吸附性( 二 )

健康知識養生常識


二、材料和方法
1、材料
醫用級不銹鋼、電致拋光、聚氨酯管（3mmID ， 4.0mmOD）檸檬酸鹽類人全血、用于免疫分析的抗體和試劑、使用96孔酶標儀用于吸光度測量 。 采用VHX600型數字顯微鏡 ， 采用100-10003變焦鏡頭進行顯微鏡分析 。 蛋白質的測定采用布拉德福德法 。
【Hydromer親水涂層具有降低血栓形成性、細胞增殖和蛋白質吸附性】2、T8B配方在不銹鋼和聚氨酯管中的應用
根據不銹鋼和聚氨酯管協議的專用配方 ， 對襯底進行清洗、底漆和涂層 。 DualityTMT8B的配方除了含有溶劑和其他次要成分外 ， 還包括聚氨酯預聚物、特定分子量的聚乙烯基吡咯烷酮和專有混合物中的抗菌劑 。 潤滑性測量是根據ASTMD1894中發布的“塑料薄膜和薄膜摩擦的靜態和動力學系數的標準試驗方法”進行的 。
簡單地說 ， 油管兩端連接 ， 油管上放置350克的重量 。 這個重量被來回移動了25個循環 ， 并且滑動重量所需的力被記錄下來 ， 并與潤滑性或摩擦系數成正比 。 經實驗確定 ， 該潤滑配方的摩擦系數為0.031 ， 而未涂層聚氨酯管的摩擦系數為0.922 。 然而 ， 需要注意的是 ， 這些值是相對的 ， 而不是絕對的 ， 并且使用涂層不銹鋼可以觀察到類似的關系 。
3、細胞和血液成分的粘附
檸檬酸人全血400g離心15min ， 獲得富血小板血漿（PRP） 。 小心地取出PRP ， 1000g離心10min ， 然后再以2000g離心10min 。 顆粒在提羅德溶液中洗滌三次 ， 然后在提羅德溶液中重懸 。 通過將50-100lL重組的重組PRP顆粒放在每個不銹鋼部分（1cm2）的中心或2厘米長的聚氨酯管腔內3小時 ， 來實現表面粘附 。 不銹鋼的每個表面最初都是用液體阻滯劑PAP筆勾畫出來的 ， 以防止液體在孵育過程中流出表面 。 粘附后 ， 細胞和血小板在室溫下用2%戊二醛固定20min 。
用緩沖液A（25mMTris ， pH7.4含0.15M氯化鈉和0.15M0.05%Tween-20）沖洗不銹鋼切片或聚氨酯管3次 。 非特異性蛋白結合位點在緩沖液A（緩沖液B）中室溫下孵育1小時 ， 阻斷非特異性蛋白結合位點 。 用緩沖液A短暫沖洗后 ， 在緩沖液B中加入100lL ， 加入1：100稀釋的一抗（CD15稀釋、CD18稀釋、CD41稀釋或CD235） ， 在48℃下孵育過夜 。
對照反應在以相同方式稀釋的非免疫小鼠IgG的存在下進行 。 第二天早上 ， 用PBS清洗了這些表面三次 。 加入100微升1：1000稀釋的生物素化抗小鼠IgG1：1000稀釋 。 在室溫下孵育1.5小時 。 采用非免疫小鼠IgG作為陰性對照 。 表面用緩沖液A洗滌兩次 ， 每次15min 。 加入100微升親和素偶聯辣根過氧化物酶（1：1000i緩沖液A） ， 在室溫下孵育30min 。 洗滌后（33,5min）后 ， 將100lL的TMB底物（Sigma-Aldrich ， 圣路易斯 ， 莫）加入到每個切片的表面 ， 并在室溫下孵育30min 。
然后將50微升停止液混合 ， 15min后 ， 記錄50lL樣品在450nm處的吸光度 。
4、細胞培養 ， 細胞培養物
人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）來自Cambrex公司（東盧瑟福 ， 新澤西州） 。 簡單地說 ， 根據供應商的說明 ， 細胞在添加了生長因子的內皮生長培養基（EGM-2）中培養 。 該培養基中的血清濃度為5% 。 高壓滅菌后 ， 不銹鋼片（1cm2）在12孔板（Fisher科學公司 ， 波士頓 ， MA）中孵育 ， 并接種83104細胞（20%融合度） 。
細胞在378C和5%二氧化碳下孵育24小時后 ， 取出碎片 ， 用PBS沖洗 ， 并與1mL合適的培養基一起放入新的12孔板中 。 我們對不銹鋼切片的分析是在細胞接近融合（80%）的條件下獲得的 。
使用小鼠成纖維細胞的標準細胞毒性試驗 ， 指定為ISO10993（“醫療器械的生物評價-第5部分：體外細胞毒性試驗”） ， 用于評估我們的配方的細胞毒性潛力 。