1. 首頁 > 健康養生 > >

經驗分享：基因治療AAV載體生產過程中rcAAV的鑒定和消除簡介

健康知識養生常識

腺相關病毒載體(adeno－associatedviralvector ， AAVvector)是一種具有良好應用前景的基因治療載體 。 但是 ， 腺相關病毒(AAV)載體制劑經常被不同量的具有復制能力的AAV病毒(rcAAV)污染 ， 這可能影響這些載體在培養細胞和動物中的行為 。 構建了不含顯著同源性且缺乏野生型AAVp5啟動子的包裝質粒/載體質粒系統 ， 以通過重組消除野生型AAV的產生 。 然而 ， 在由這些質粒大規模共轉染產生的載體中檢測到rcAAV 。 序列分析顯示非同源重組是這些新的重組體產生的原因 。 構建了一種新的AAV包裝質粒 ， 該質粒以相反的轉錄方向攜帶單獨的rep和cap表達盒 。
經驗分享：基因治療AAV載體生產過程中rcAAV的鑒定和消除簡介
文章圖片
方法：利用PCR方法檢測293,A549,andIB3細胞中的rcAAV
1、實驗結果
質粒圖譜和PCR策略分析AAV種的結構 。
經驗分享：基因治療AAV載體生產過程中rcAAV的鑒定和消除簡介
文章圖片
圖1.質粒圖譜和PCR策略分析AAV種的結構 。
A.tgAAVCF載體,pGEM-RS5包裝質粒 ， 野生型的AAV,和假設的rcAAV結構 。 引物D被設計在TR區域 。
B.AAV包裝質粒MTrep/CMVcap和AAV-LAPSN,和AAV-GrTHLAP基因組 。 箭頭表示轉錄起始位點和開放框表示編碼區 。
2、用帶有連接的rep和cap基因的AAV包裝構建體生產的載體制劑中rcAAV的檢測
經驗分享：基因治療AAV載體生產過程中rcAAV的鑒定和消除簡介
文章圖片
在tgAAVCF載體中檢測到一個復制的AAV種 。 將測試樣品加入到含有或不含有腺病毒的293個細胞中 ， 培養細胞72小時 ， 分
【經驗分享：基因治療AAV載體生產過程中rcAAV的鑒定和消除簡介】3、rcAAV檢測
經驗分享：基因治療AAV載體生產過程中rcAAV的鑒定和消除簡介
文章圖片
圖3.PCR方法擴增tgAAVCF載體 ， 電泳分析 。
引物序列如下：
rcAAV:
Dregion,59-CTCCATCACTAGGGGTTCC-39(AAV2nt126to144);
rep,59-GGCAGATGCCCGTCAAGGT-39(AAV2nt379to361);
cap,59-CAGAGATGTGTACCTTCAG-39(AAV2nt4026to4044).
4、生產沒有污染的rcAAV的AAV載體
經驗分享：基因治療AAV載體生產過程中rcAAV的鑒定和消除簡介
文章圖片
交叉序列的精細結構分析 。 P2到P5序列是TRD區rep擴增序列;SN7和SN9是TRD區cap擴增序列 。
經驗分享：基因治療AAV載體生產過程中rcAAV的鑒定和消除簡介
文章圖片
克隆的rcAAV交叉分析點
P2到P5序列是TRD區rep擴增序列;SN7和SN9是TRD區cap擴增序列 。
經驗分享：基因治療AAV載體生產過程中rcAAV的鑒定和消除簡介
文章圖片
圖6.在AAV-LAPSN病毒體中檢測rcAAV
經驗分享：基因治療AAV載體生產過程中rcAAV的鑒定和消除簡介
文章圖片
在AAV-GrTHLAP病毒體中檢測rcAAV
結論
1.序列分析顯示非同源重組是rcAAV產生的原因 。
2.構建了一種新的AAV包裝質粒 ， 該質粒以相反的轉錄方向攜帶單獨的rep和cap表達盒 。 使用這種包裝結構生產的AAV載體制劑不含rcAAV
盡管將AAV載體設計為具有復制缺陷 ， 但在生產載體的過程中 ， 仍然可以通過生產細胞內的重組事件來產生具有復制能力的AAV(rcAAV) 。 rcAAV可能會在基因治療產品的生產過程中的任何步驟發展 。 盡管專門開發了載體生產系統以降低rcAAV產生的風險 ， 但仍然存在重大安全隱患 ， 因此提出了在細胞庫中測試rcAAV ， 基于AAV的基因治療產品的載體和最終產品的建議 。
臨床上許多AAV載體中rcAAV的存在引起了多種安全問題：
1.基于逆轉錄病毒或腺病毒載體的基因治療產品中可能存在rcAAV
2.影響這些載體在培養細胞和動物中的行為
3.與內源性AAV序列的體內重組
4.由于存在野生型輔助功能 ， 導致意外的載體復制
來源大分子生物
參考文獻:
1.GuidanceforFDAReviewersandSponsors:ContentandReviewofChemistry,Manufacturing,andControl(CMC)InformationforHumanGeneTherapyInvestigationalNewDrugApplications(INDs).