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圖8.PROTAC62及陰性對照63和64的化學結構
首先 ， 作者分別測試了PROTAC62、63、64及靶頭化合物ARQ-092對AKT三種不同亞型（AKT1、AKT2、AKT3）的酶抑制活性（圖9） 。 實驗結果顯示 ， 相較于靶頭化合物ARQ-092 ， PROTAC表現出減弱的抑制活性 ， 但對于AKT1/2/3都具有抑制活性 。

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圖9.PROTAC62、63、64及ARQ-092的酶活測試
接下來 ， 作者測試了PROTAC62、63、64在MS21（已報道的降解活性最好的靶向活性位點PROTAC）耐藥且KRAS突變的結直腸癌細胞系SW620的降解活性（圖10） 。 實驗結果表明 ， 化合物62能夠呈現濃度依賴方式有效誘導SW620中的AKT降解 ， 且DC50為23±16nM ， 而陰性對照63和64無降解活性 。

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圖10.化合物62在sw620中的降解實驗
隨后 ， 作者比較了62和MS21在其他幾種攜帶KRAS或BRAF突變的癌細胞類型中的AKT降解效應（圖11） 。 蛋白質印跡實驗發現 ， 化合物62可以有效誘導各種KRAS或BRAF突變的癌細胞中AKT的降解 ， 而MS21表現出較差的AKT降解能力 。

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圖11.62和MS21在各種攜帶KRAS或BRAF突變的癌細胞蛋白降解實驗
作者繼續在SW620細胞系進行了蛋白降解機制研究（圖12） ， 實驗結果表明化合物62可以以時間依賴的方式誘導AKT降解 ， 并可以有效抑制磷酸化PRAS40蛋白水平 。 當加入NAE抑制劑MLN4924或蛋白酶體抑制劑MG132后 ， 可以有效逆轉AKT的降解效果 。 基于上述實驗結果 ， 作者認為化合物62誘導AKT蛋白的降解效果依賴于泛素蛋白酶體途徑 。

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圖12.蛋白降解機制研究實驗
為了探究PROTAC62蛋白質組范圍內的降解選擇性 ， 作者對化合物62進行了基于全局串聯質譜標簽TMT定量蛋白分析的蛋白質組學研究 ， 實驗結果表明化合物62不能降解其他靶點蛋白 ， 具有較好的靶點選擇性（圖13） 。

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圖13.化合物62的蛋白質組學研究
接下來 ， 作者在SW620細胞系上測試了化合物62、靶頭化合物ARQ-092、陰性對照64及降解劑MS21的抗增殖活性（圖14） 。 從細胞集落形成實驗可以看出 ， 化合物62對SW620抑制活性與ARQ-092相當 ， 而陰性對照化合物64和MS21表現出較弱抑制活性 。
圖14.化合物62、64、ARQ-092、MS21的細胞集落形成實驗
最后 ， 作者對化合物62進行了PK研究（圖14） ， 評估化合物62在小鼠體內的生物利用度 。 實驗結果發現在給藥后0.5h可達到最大血藥濃度（Cmax=1μM） ， 血藥濃度保持在100nM以上至少可維持12小時 。 這些結果表明 ， 化合物62表現出較好的PK性質 ， 在體內可以獲得足夠的血漿暴露 。

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圖14.化合物62在小鼠血漿濃度測試
總結
金堅課題組報道了首個靶向變構位點的AKTPROTAC62 ， PRORAC62能夠有效誘導KRAS/BRAF突變腫瘤細胞的AKT降解 ， 這可能為靶向活性位點的MS21耐藥KRAS/BRAF突變癌癥提供一個潛在的策略 。 同時 ， 化合物62表現出較強的降解活性、較好的靶點選擇性以及較好的PK性質 ， 這是靶向AKTPROTAC領域的一大步 ， 也是靶向AKT領域的藥物研發的一大步 。
參考文獻
1、NovelAllostericInhibitor-DerivedAKTProteolysisTargetingChimeras(PROTACs)EnablePotentandSelectiveAKTDegradationinKRAS/BRAFMutantCells.
2、ExploitingthePI3K/AKTpathwayforcancerdrugdiscovery.Nat.Rev.DrugDiscovery2005,4(12),988?1004.

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