經驗分享：如何高效表征基因治療中腺相關病毒載體( 二 ) _健康小知識

尺寸排阻色譜（SEC）
尺寸排阻色譜（SEC）是一種分離技術，可根據分子進出柱中多孔凝膠基質的流體力學半徑來分離分子。搭配一系列先進的檢測器，如光散射（LS）、UV、RI和粘度，可以測量絕對分子量、分子大小、特征粘度、支化和其他參數。
差式掃描量熱法（DSC）
差式掃描量熱法（DSC）是一種直接分析天然蛋白質或其他生物分子熱穩定性的技術，無需外在熒光素或者內源熒光，它通過測定在恒定的升溫速率下使生物分子發生熱變性過程中的熱容變化來實現。
案例研究|綜合使用多種技術表征rAAV性狀：衣殼分子量、聚集狀態、滴度、穩定性……
1 ，空rAAV5衣殼分析
SEC-MALS(OMNI-SEC)測量產生的關鍵數據是絕對分子量，與柱保留時間或用于校準系統的任何標準無關。在空rAAV的情況下（Fig.1和表2），主要單體的Mw為3.84x106g/mol 。空衣殼蛋白的理論分子量為3.8x106g/mol ，證實該分析結果符合預期。

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圖1rAAV5空殼三重色譜圖

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表2rAAV5空殼的定量參數
Mw/Mn描述樣品的分散性，接近1的值表示峰中有單個群體，遠高于1的值表示峰內有多個群體。在空rAAV的情況下，單體和二聚體的Mw/Mn值接近1 ，表明是單一群體。聚集體和碎片Mw/Mn值顯著高于1 ，表明單個峰內具有不同分子量的多個群體（表2）。
樣品的分數（FractionofSample）描述了樣本在群體之間的分布情況，在這種情況下， 84.7%的樣品是單體。蛋白質分數（FractionofProtein）表示樣品中衣殼的百分比；在這種情況下，單體是99.8%的衣殼。這證實樣品是空的rAAV5 。從這種單一分析方法中獲得的另一個關鍵信息是樣品滴度；在這種情況下，對于空的rAAV5 ，測得的滴度為5.91x1013vp/mL 。
2 ，完整rAAV5衣殼分析
完整rAAV5衣殼的SEC-MALS(OMNISEC)分析如圖2和表3所示。對于主要的單體峰，計算出的符合Mw為4.49x106g/mol ，其中86%為衣殼。這樣，完整的rAAV5的蛋白質組分的Mw為3.86x106g/mol ，與表2中的空rAAV5衣殼生成的數據一致。單體部分占比93% ，樣品具有總滴度7.48x1013vp/mL 。

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圖2完整rAAV5的三重色譜圖

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表3完整rAAV5的定量參數
3 ， rAAV5穩定性研究
病毒衣殼的穩定性和功能是一種平衡行為。病毒衣殼必須足夠穩定以包含和保護其中的基因組，與宿主細胞表面結合，它們必須提供足夠的構象穩定性以在復制位點釋放基因貨物。
AAV載體脫殼的機制仍然知之甚少。衣殼脫殼和基因組釋放似乎需要結構變化。基于差示掃描熒光法和差示掃描量熱法（DSC）收集的AAV熱穩定性已發表數據， AAV熱轉變的Tm值與衣殼解聚過程有關，可作為AAV血清型的鑒定指標；一種血清型的空AAV衣殼和完整AAV衣殼的Tm值通常非常相似，并且它們與衣殼動力學、衣殼脫殼和基因組釋放沒有明顯的相關性。

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表4從DSC獲得的空rAAV5和完整rAAV5樣品的熱穩定性結果
文章中記錄的完整和空rAAV5樣品的DSC曲線疊加（圖3），根據空rAAV5和完整rAAV5樣品的整體DSC圖譜差異以及熱穩定性參數（如Tonset和Tm2 ，表4），可以在圖3中DSC曲線上識別出四個不同的區域，它們可以暫且歸因于以下幾點：