經驗分享：活細胞RNA成像技術及其在生物醫學中應用研究進展( 二 ) _健康小知識

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圖1MS2/MCP系統成像技術原理示意圖
融合表達熒光蛋白的MCP二聚體與MS2莖環結合實現RNA成像.MCP：MS2衣殼蛋白.
Figure1SchematicdiagramofMS2/MCPsystem
1.1.2
Larson等[13]基于假單胞菌RNA噬菌體的PP7開發了PP7/MCP系統（圖2），其標記RNA的原理與MS2/PCP系統相同。噬菌體PP7的外殼蛋白與其同源RNA結構具有較強的親和力[34] 。研究者使用PP7/PCP系統來研究酵母細胞內新生RNA的動力學，包括mRNA轉錄起始、伸長和終止。 Li等[35]利用PP7/PCP系統在秀麗線蟲中對mRNA在細胞內的定位和轉運過程進行高時空分辨率跟蹤。 PP7/PCP系統與MS2/MCP系統聯用可實現在單個細胞中RNA的雙色標記，從而同時對多種RNA進行成像跟蹤[36] 。此外，與MS2相比， PP7莖環與PCP結合效率較高，因此提高了RNA標記的信噪比[37] 。

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圖2PP7/PCP系統成像技術原理示意圖
融合表達熒光蛋白的PCP二聚體與PP7莖環結合實現RNA成像.PCP：PP7衣殼蛋白.
Figure2SchematicdiagramofPP7/PCPsystem
1.1.3
boxB/λN22系統由Daigle和Ellenberg開發，并首先在哺乳動物細胞中應用[14] ，其主要基于λN22蛋白與15ntboxBRNA莖環結合進行RNA標記（圖3）。 RNA結合蛋白和適配體尺寸小是該系統的優勢，有利于減少對所標記RNA特性的影響。 boxB/λN22系統是僅次于MS2/MCP及PP7/PCP的第三位常用系統，可以提供mRNA及其轉運分子在細菌、真菌、植物和哺乳動物細胞中各種生命過程中動態行為的相關信息[14 ， 38-40] 。

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圖3boxB/λN22系統成像技術原理示意圖
融合表達熒光蛋白的λN22單體與boxB莖環結合實現RNA成像.
Figure3SchematicdiagramofboxB/λN22system
1.1.4
CRISPR-Cas系統主要運用于DNA和RNA編輯領域。通過改造Cas蛋白，使其無法剪切核酸分子但仍保留與DNA或RNA的結合能力，從而實現DNA和RNA的成像。 dCas9（來源于化膿性鏈球菌）通過與GFP融合，借助一條稱為PAMer的寡脫氧胸腺苷酸，能夠識別并結合內源性mRNA ，從而實現RNA成像[41] 。 PAMer與靶向的單鏈mRNA結合，產生了PAM位點，巧妙地讓dCas9識別并結合RNA 。 CRISPR-Cas13是近期被鑒定為RNA引導及RNA靶向的核糖核酸酶蛋白家族，包括Cas13a[42]、Cas13b[43]、Cas13c[43]、Cas13d[44]、Cas13X.1[45]和Cas13bt[46] 。 CRISPR-Cas13已經在哺乳動物細胞中實現了精確的RNA靶向和編輯[42 ， 45-46] 。 CRISPR/dCas13也在活細胞中被應用于RNA成像[16]（圖4）。通過crRNA介導，融合熒光蛋白的dCas13b蛋白結合靶RNA從而實現RNA標記。 Yang等[16]測試了dCas13a、dCas13b及dCas13d等多個系統，發現dPspCas13b標記RNA的效率較高且具有特異性，其次是dPguCas13b 。 crRNA靶序列的長度在20~27nt間較為有效。 CRISPR-dCas13b系統成像RNA的優勢是不需要對基因組進行編輯，其不足之處是crRNA的結合效率不確定。標記一條特異的RNA需要設計并構建多個crRNA ，能富集的熒光蛋白分子數也較為有限。因此，提升RNA標記的信噪比是CRISPR-dCas13系統的主要挑戰。

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圖4CRISPR/dCas13系統成像技術原理示意圖
在crRNA介導下，融合表達熒光蛋白的dCas13蛋白靶向RNA ，實現RNA成像.CRISPR:成簇的、規律間隔的短回文重復序列；crRNA：CRISPRRNA；dCas：失活的Cas.
Figure4SchematicdiagramofCRISPR/dCas13system
1.2
熒光染料由于靈敏度高、操作方便，逐漸取代放射性同位素作為檢測標記廣泛應用于熒光探針和細胞染色等。熒光RNA適體是折疊成可以結合特定靶標的特定三級結構寡核苷酸。適體（DNA、RNA或蛋白質）可以與配體（如染料分子）結合，具有非常高的特異性。這些染料分子通常不發熒光，但在結合同源適體時會產生明亮的熒光信號，從而有利于提高RNA標記的信噪比[47] 。