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經驗分享：活細胞RNA成像技術及其在生物醫學中應用研究進展( 三 )

健康知識養生常識


1.2.1
分子信標是用于靶向內源性轉錄本的探針[48] 。 Tyagi等[17]開發的分子信標是發夾形的寡核苷酸雜交探針（圖5） ， 一端設計有熒光基團 ， 另一端設計有猝滅基團 。 在與靶序列特異性雜交時 ， 熒光基團和猝滅基團分離并發光 。 由于這些探針不能穿透細胞 ， 而需要進行顯微注射或引入 ， 這限制了分子信標的應用 。 在過去的二十年中 ， 研究人員通過優化熒光猝滅基團[49-50]和熒光基團[51-52]以及莖的結構[53]等方法改進分子信標技術 ， 擴大了其在生物成像、基因治療和藥物遞送等生物醫藥領域應用[54-55] 。 Chen等[56]通過分子信標技術實現了單個長鏈非編碼RNA的定位 。
經驗分享：活細胞RNA成像技術及其在生物醫學中應用研究進展
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圖5分子信標成像技術原理示意圖
分子信標探針的兩端分別是熒光基團和猝滅基團 ， 一旦與靶RNA結合 ， 兩端分開 ， 熒光基團發光.
Figure5Schematicdiagramofmolecularbeacon
1.2.2
通過結合DFHBI（GFP熒光基團的類似物）發出熒光的適體包括Spinach和Broccoli等 。 第一個為RNA成像開發的RNA-熒光基團復合物稱為Spinach（以產生的綠色熒光信號命名） ， 由Jaffrey及其同事于2011年開發[57] 。 其后發現更多的染料及相應的適體對 ， 后者均以蔬菜和水果命名 ， 如Broccoli和iSpinach等 。 以上RNA適體與配體結合后才發光 ， 有效降低了背景熒光（圖6） 。 但其在運用上仍有局限性 ， 如相對較低的熒光亮度和熱、光穩定性 ， 且可選熒光顏色單一 ， 從而可能阻礙其廣泛應用 。
Chen等[18]開發了一系列合成染料（簡稱HBC） ， 其類似于GFP的發光基團 。 他們通過大規模篩選與HBC結合的適體 ， 開發了最新一代適體 ， 命名為Pepper 。 不同HBC可以發射出不同波長的光譜 ， 因此Pepper系統是一系列具有高亮度及穩定性的RNA標記體系 ， 具有從青色到紅色的廣泛發射光譜 ， 能夠與其他分子標記體系具有更好的兼容性 。 HBC在游離狀態下不發光 ， 但與Pepper結合后發出的熒光強度比Broccoli等體系高一個數量級 ， 其在活細胞中顯示出良好的膜滲透性、低細胞毒性和低背景信號 。 Pepper能對活細胞中的mRNA和其他RNA種類進行可靠的成像 ， 同時對靶RNA的轉錄、定位和翻譯的干擾較小 。
Mango系統同樣是由RNA的Mango適體與染料（TO1-Biotin）結合而發光 。 最新開發的MangoⅡ適體由于其莖環結構簡單 ， RNA標記具有很高的信噪比 ， 單分子RNA成像靈敏度高 ， 可能會得到較為廣泛的應用[19] 。 利用Mango系統可以實現對哺乳動物固定和活細胞中三種非編碼小RNA（如5S、U6）的亞細胞定位進行成像[58] 。
熒光基團-適體需要添加染料才可用于RNA活細胞成像 ， 因此其應用受到限制 ， 但仍是一種非常有前景的RNA成像技術 ， 優化潛力大 。
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圖6RNA適體成像原理示意圖
單獨的染料和RNA適體都不發光 ， 而兩者結合會迸發出強烈的熒光.
Figure6SchematicdiagramofRNAaptamer
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2
RNA成像技術的發展推進了RNA領域的研究 ， 加深了我們對RNA轉錄、剪接、轉運、定位及成熟RNA翻譯等過程的理解（圖7） 。 以下列舉了一些利用活細胞成像技術在以上領域中的研究發現（表2） 。
2.1
轉錄是細胞以DNA為模板合成RNA的過程 。 在真核生物中 ， 活細胞RNA成像及定量結果表明轉錄表現為一個隨機過程 ， 其特征是短時間（數分鐘）的強烈活動或分散在長時間（30min到數小時）過程中的間歇式轉錄爆發[66-67] 。 理論上 ， 基因轉錄可以通過基因在轉錄激活（開啟）和轉錄失活（關閉）兩種狀態之間切換[68-70] 。 管家基因在發育過程中通過強烈調節轉錄爆發強度 ， 從而在單細胞轉錄水平上實現更大的調節空間[12] 。 轉錄爆發的調控主要通過調節轉錄爆發的持續時間或啟動子啟動速率（Kon）進行 ， 而可能與轉錄關閉時間長短或啟動子關閉速率（Koff）無關[33 ， 59 ， 71] 。 Alamos等[60]利用MS2/MCP及PP7/PCP系統進行活細胞RNA成像 ， 分析煙草和擬南芥中熱激反應基因的轉錄動態 ， 結果發現植物組織通過提高可轉錄細胞的比率而不是增強轉錄強度來實現整個組織水平的基因表達上調 。 在各項生命活動中 ， 細胞通過不斷調整轉錄過程來響應細胞需求的變化 。 通過轉錄爆發行為性質的研究 ， 可以推斷其分子調控機制 ， 爆發的頻率和振幅的可調節性導致表達異質性 。 因此 ， 分析轉錄爆發的一些關鍵參數 ， 如振幅（轉錄強度）、頻率和持續時間 ， 可有助于理解生物在面臨不同外界刺激時作出的即時轉錄調節的分子機制 。