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經驗分享：活細胞RNA成像技術及其在生物醫學中應用研究進展

健康知識養生常識

細胞內的生命活動依賴于蛋白質和RNA 。 DNA通過轉錄生成多種協同工作的RNA 。 其中非編碼RNA參與催化、調節功能以及結構組成 ， 而mRNA可進一步通過翻譯決定蛋白合成 。 單細胞和多細胞生物通常依靠基因表達模式的變化來決定單個細胞的命運 。 因此 ， 在分子水平上理解活細胞內RNA如何轉錄、剪接、轉運、降解和亞細胞定位等過程具有重要的生物學意義 。
RNA成像是研究RNA生物學的重要工具 ， 主要包括固定細胞成像和活細胞成像 ， 固定細胞的成像基于FISH[1] 。 其中單分子FISH可以實現單分子RNA的成像 ， 并對轉錄水平和轉錄本積累進行量化[2-5] 。 目前單分子FISH已經能實現對全基因組范圍內的轉錄本進行檢測[6] 。 最近幾年開發的Slide-seq是高分辨率且保留空間信息的單細胞測序技術 ， 能夠原位研究組織樣本的轉錄組[7] 。 盡管使用這些固定細胞的RNA成像技術可以獲得大量信息 ， 但無法提供關鍵的時間維度 ， 無法為基因表達調控及RNA本身的動態調控提供更全面的信息 。 隨著顯微鏡和熒光標記技術的不斷發展 ， 研究者可以在活細胞中高時空分辨率地追蹤單個RNA ， 對RNA分子動力學進行精確量化研究[8-10] 。 本綜述概述了活細胞RNA成像技術的發展和運用 ， 旨在促進活細胞RNA成像技術在生物醫學領域的廣泛應用 。
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活細胞RNA成像可以提供不同類型細胞內RNA的表達、定位、降解、儲存和調節等綜合信息 ， 對基礎生物學和臨床研究都至關重要 。 在過去二十年中 ， 研究者開發了多種活細胞RNA成像技術 ， 主要包括基于熒光蛋白的成像技術和基于熒光染料的成像技術（表1） 。 以下對具有代表性的標記技術做簡要介紹 。
1.1
使用熒光蛋白（如GFP）直接融合RBP來標記RNA是活細胞RNA成像的一個重大進展 。 本文將重點介紹使用最廣泛的遺傳編碼的RNA報告系統 。
1.1.1
MS2/MCP系統是Bertrand等[11]在1998年描述的首個遺傳編碼的RNA成像系統 。 MS2/MCP系統為RNA加工、定位和轉運提供了大量信息 ， 是研究各種模式生物中RNA動態的最常用方法[21-25] 。 噬菌體MCP與病毒RNA中獨特的RNA發夾序列（MBS）緊密結合 ， 形成病毒衣殼結構 。 MCP-熒光蛋白作為二聚體可以結合MS2莖環 ， 見圖1 。 研究者通過將多個重復的MS2序列插入到目標RNA中 ， 從而實現單個轉錄本可視化[11] 。 重復的核苷酸序列可以實現熒光信號的放大從而提高熒光成像的信噪比 。 然而 ， 重復序列由于自身的不穩定可能會引起MS2序列的異常缺失和降解 ， 從而影響RNA檢測和理解其生物學功能的精確性 。 Wu等[26]通過突變MBS序列中的非必需核苷酸 ， 獲得包含24個不同的MBS且中間含30nt隨機接頭的24×MBSV5 ， 顯著增強了MS2序列的穩定性 ， 使結果分析更加準確 ， 從而優化了MS2/MCP系統 。 研究表明 ， 酵母中MCP與MS2的緊密結合以及莖環之間的短距離導致含MS2陣列的mRNA降解速度較慢 ， 潛在影響了mRNA的壽命、亞細胞定位及表達[27-30] 。 在MBSV6和MBSV7等新版本中 ， 研究者加長了MS2莖環之間的距離 。 在MBSV6中 ， 研究者用50個堿基的接頭分隔每個MS2莖環；而在MBSV7中 ， 隨機接頭為40個堿基[31] 。 對于MBSV6 ， 研究者還將莖環中一處胞苷（C）替換成尿苷（U）以減小其對MCP的親和力 ， 但仍保留了實時成像的單分子檢測能力 ， 這顯著改善了MS2標記的靶mRNA在酵母細胞內的降解問題[31] 。 MBSV6的不足之處是光漂白快 ， 不利于長時間成像 。 相比之下 ， MBSV7可以實現更明亮的單分子標記和更長時間的活細胞成像 。 另外 ， MBSV7/MCP不影響哺乳動物細胞內靶基因mRNA的正常降解[32] ， 因此MBSV7適用于哺乳動物細胞內的活細胞RNA成像 。 Xu等[33]將CRISPR/dCas9成像技術與MS2/MCP系統聯用 ， 將12個拷貝的MBSV5發夾序列與含12個dCas9識別序列的CRISPR-Tag相間排列 ， 并將其放置于熒光蛋白的內含子中 。 通過將該標簽插入到靶基因的氨基端或羧基端 ， 從而實現在一個活細胞中內源基因DNA、新生RNA和蛋白的三重可視化 ， 因此該熒光標簽被命名為TriTag 。 MS2/MCP系統已經在多個物種中實現內源RNA的可視化 ， 但其不足之處是需要對標記的RNA進行序列上的改造 ， 這可能會導致RNA特性的潛在改變 ， 影響標記mRNA的表達及穩定性 。