經驗分享：懸浮細胞中生產 AAV 載體細胞培養工藝開發簡介( 二 ) _健康小知識

種群倍增時間(PDT)平均約為20小時，圖4.在10次傳代中保持了良好的細胞活力(>97%) 。

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圖4.(A)在10次傳代中HyCell?TransFx-H培養基中生長的細胞的群體倍增時間。 (B)10次傳代中的細胞活力。
利用質粒構建體進行AAV工藝開發
質粒構建體包含生產AAV所需基因和DNA序列，并在我們的工藝開發中采用，最初由NordicBiosite提供。
【經驗分享：懸浮細胞中生產 AAV 載體細胞培養工藝開發簡介】AAV生產中的質粒擴增通過使用質粒轉化細菌來實現。隨后在培養轉化細菌時復制質粒DNA 。通過使用質粒純化試劑盒，可以從收獲的材料中回收大量的質粒DNA 。
實驗設計(DoE)；使用HEK293T懸浮細胞優化的rAAV生產方案
進行了一系列實驗設計(DoE)研究以評估轉染的最佳條件。總共開展了五項研究，其中四項是針對rAAV2的。在我們的工藝開發過程中，目標是達到以下條件以滿足下游工藝的要求：1014個病毒顆粒(VP)/L ， 1013個病毒基因組(VG)/L ，以及收獲材料中完整衣殼的百分比為10%及以上。實驗設計(DoE)研究1–4表明我們無法滿足rAAV2的所有要求，因此，對開發的轉染方案進行了rAAV5測試。因此DoE5設計為一項驗證研究，用于確認rAAV5生產的最佳DNA濃度和DNA-PEI復合物孵育時間。
DoE1
DoE1研究了質粒DNA濃度、不同細胞密度、PEI/DNA比率、轉染體積和孵育時間（表1）。為了驗證不同條件的影響，對轉染效率進行了研究。
表1DoE1設置中使用的參數

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在瞬時轉染中， PEI將質粒DNA濃縮成帶正電荷的顆粒，與陰離子細胞表面相互作用， PEI/DNA復合物通過內吞作用進入細胞。 PEI/DNA的比例對轉染效率起到關鍵作用。我們使用MODDE?Prov12.0.1軟件(SartoriusStedimGmbH)評估了DoE1中的所有參數，該軟件匯總并評估了所有數據。我們通過評估結果就能夠預測出應該使用哪些參數來實現高轉染效率（圖5）。

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圖5.要在轉染后72小時后實現最佳轉染效率， (A)轉染體積需要為總體積的6% 。 (B)增加轉染孵育時間會對轉染效率產生不利影響。
DoE2
根據DoE1的評估結果對第二部分(DoE2)的以下參數進行了設置。在DoE2中研究和評估了溫度和DNA質粒比率。
DNA的最佳數量取決于轉染質粒的特性（例如，質粒的大小、復制來源）。各種基因的份額也會影響產量，并對pAAV-RC2載體(a)、pHelper載體(b)和pAAV-GFP載體(c)進行了不同比例的測試。我們還評估了rAAV生產過程中不同溫度下對轉染效率的影響—溫度分別為34°C、35.5°C和37°C 。
DoE1和DoE2之間的差異在圖6中用圓圈標記。

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圖6.與用圓圈標記的DoE1的參數相比， DoE2中評估的參數與HEK293T細胞（GFP表達細胞的百分比）的轉染效率提高相關。
AAV感染性和隨后的GFP表達由轉導測定確定。通過轉導分析對裂解的樣品進行定量，并通過流式細胞儀進行評估，由轉導細胞表達GFP陽性細胞，并且使用結果計算感染滴度(TU/mL) 。這表明DNA比率差異與提高感染滴度有關。
DoE2中基于轉導測定的各種參數如圖7所示。圓圈表示DoE2相較于DoE1的改進之處。

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圖7.在DoE2中評估的有助于提高HEK293T細胞感染滴度的參數。 DoE1中的條件被圈出，
DoE3
qPCR可以幫助我們分析病毒基因組滴度。這對于進一步優化工藝和增加收獲材料中完整衣殼的份額非常重要。通過比較qPCR的VG滴度數據(VG/L)與ELISA檢測到的衣殼蛋白數量（衣殼/mL），可以估計完整衣殼的百分比。很明顯，轉染效率與病毒滴度（通過ELISA和qPCR測量）的相關性較差。