經驗分享：懸浮細胞中生產 AAV 載體細胞培養工藝開發簡介( 三 ) _健康小知識

當VCD增加至1×106/mL時，病毒基因組滴度會有所提高。
DoE4
在下游純化工藝中，完整衣殼的百分比和VG是有效分離完整衣殼的最重要因素。我們需要保證收獲物中完整衣殼的百分比至少為10%才能進行rAAV2純化。因此另外對rAAV2進行了一次實驗設計(DoE)評估，這次研究了DNA濃度和收獲時間(ToH)對生產過程中病毒基因組滴度和完整衣殼百分比的影響。
我們發現，盡管增加DNA濃度可以提高VG滴度，但會對完整衣殼的百分比產生不利影響（圖8）。我們發現，為了獲得高VG滴度但同時完整衣殼的百分比達到10%及以上， DNA濃度需為0.75μg/mL 。
在這些條件下，收獲時間對VG滴度和完整衣殼的百分比沒有顯著影響。

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圖8.DoE4中評估的參數表明，盡管增加DNA濃度會提高VG滴度(A) ，但完整衣殼的百分比(B)會受到不利影響。
通過總結rAAV2實驗設計(DoE)1–4的結果，可以看出VG滴度和完整衣殼百分比隨著時間的推移在逐步改善（圖9）。但是沒有達到我們關于完整衣殼百分比的標準，大家普遍認為AAV2進行完整衣殼優化有難度。因此，我們決定對已確定的AAV5（臨床上另一個重要的血清型）的條件進行測試。

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圖9.實驗設計(DoE)研究發現VG滴度(A)和完整衣殼百分比(B)隨時間推移而改善。
DoE5
我們證實了我們的AAV2轉染方案可用于AAV5生產。 DNA濃度和轉染孵育時間這兩個參數十分重要。結果證實了DoE4中的發現：增加DNA濃度可提高VG滴度并降低完整衣殼百分比；轉染時間對VG響應的影響很小（圖10）。

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圖10.(A).增加DNA濃度可以提高VG滴度。轉染孵育時間對VG響應沒有顯著影響。 (B).增加DNA濃度會降低完整衣殼的百分比。使用低濃度DNA時，轉染孵育時間對完整衣殼百分比的影響更大。
我們在實驗設計(DoE)中進行了一項設計-空間優化模型測試，對獲得10%或15%的完整衣殼百分比的概率進行評估。完整衣殼的百分比越高，用于選擇轉染參數的區域就越小（圖11）。

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圖11.我們用于研究達到(A)10%完整衣殼百分比和(B)15%完整衣殼百分比（綠色區域）概率的設計-空間優化模型。
在我們的實驗設計(DoE)實驗中，我們發現，高濃度的DNA可以提高VG滴度，并且轉染孵育時間不會顯著影響VG滴度。然而，通過查看完整衣殼百分比，我們卻看到了相反的效果；通過降低DNA濃度和縮短孵育時間，可以提高完整衣殼的百分比。
總之， DoE5研究中對rAAV5生產的驗證表明，縮短轉染孵育時間對完整衣殼的百分比有積極影響。根據實驗設計(DoE)實驗中的響應結果，我們得出結論，在轉染過程中， DNA濃度為0.75μg/mL ，孵育時間為15分鐘，這可能是測試條件下的最佳狀態。
優化的轉染方案
最終的轉染方案和參數如下表2所述：
表2.轉染方案采用的最終參數

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為了確認轉染孵育時間為15分鐘的rAAV5生產轉染方案，我們在ReadyToProcessWAVE?25生物反應器中進行了10L生產。使用生物反應器進行的收獲滿足了下游工藝中進一步純化的所有驗收標準。
結論和討論
我們使用HyClone?培養基對HEK293T細胞進行了無血清懸浮生長馴化。通過直接移至新培養基中，可以在短時間內有效馴化細胞。細胞活力非常高，并且大多數細胞處于單細胞懸浮狀態。細胞在HyCell?TransFx-H培養基中快速生長，群體倍增時間約為20小時。快速的細胞生長將縮短種子細胞培養放大和生產所需的時間。