經驗分享：懸浮細胞中生產 AAV 載體細胞培養工藝開發簡介 _健康小知識

病毒載體被越來越多地用于將基因移至特定組織或誘導細胞類型修飾。已經研究了數種病毒在細胞和基因療法中的用途，其中重組腺相關病毒(rAAV)是最有希望用于基因療法的載體。細胞和基因療法行業致力于采用現行藥品生產質量管理規范(cGMP)進行高效的病毒載體大規模生產。為了滿足rAAV臨床使用的大批量需求，公司正從使用貼壁HEK293細胞生產轉變為采用懸浮細胞培養的更具可放大性的技術。此外，瞬時轉染方案也正在進行優化，以提高懸浮培養的規模和效率。
在此我們利用實驗設計(DoE)方法來優化HEK293T懸浮細胞系統中的rAAV生產。經驗證，一種高效、可放大的AAV生產的細胞培養工藝—最初使用rAAV2血清型作為rAAV的模型—也可以用于rAVV5 。
我們描述的實驗分為兩個步驟：首先，我們描述如何使用新細胞培養基進行細胞馴化。我們通過這些實驗從群體倍增時間(PDT)、形態和活力方面對細胞生長情況進行評價。此外，我們的實驗設計(DoE)可以評估多種因素的影響，例如質粒濃度、細胞密度和收獲時間。這些因素可能是未來進行可放大性AAV生產的關鍵因素（從小規模的搖瓶到25L一次性生物反應器系統）。然后我們描述如何優化構成一次性生物反應器的放大AAV生產工藝基礎的AAV瞬時轉染。
為了生產rAAV-2 ，我們使用了三重質粒轉染系統為HEK293細胞和變體生產rAAV-2提供所需基因。第一種是攜帶E2A、E4和VA基因的pHelper質粒。第二種是用于特定血清型的復制和衣殼(rep/cap)質粒。第三種是帶有目標基因（GOI–本研究中采用的GFP基因）和反向末端重復序列(ITR)的質粒，用于維持病毒的感染能力（圖1）。

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圖1.使用三重質粒轉染方法對馴化的HEK293T細胞進行瞬時轉染。聚乙烯亞胺(PEI)首先與DNA形成復

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圖2所示是我們描述的該應用中AAV生產的上游策略。
圖2.我們的策略是開發完整的AAV生產流程；我們在本文中詳細介紹了細胞培養和轉染的工藝開發。
詳細的材料和方法見文末。
HEK293T細胞在無血清AAV生產中的馴化
我們使用HyClone?細胞培養轉染培養基HyCell?TransFx-H馴化貼壁HEK293T細胞。材料和方法中介紹了馴化的詳細方案。同時，按照相同的策略用同樣的培養基成功馴化了HEK293細胞（無SV40大T抗原）（未提供相關數據）。
將加入高糖和10%HyClone?胎牛血清(FBS)的經典HyClone?DMEM培養基培養的細胞直接移至新的轉染培養基中，進行馴化。培養基中加入了4mMHyClone?L-谷氨酰胺和0.1%Pluronic?F-68(ThermoFisherScientific?) 。 HEK293T懸浮細胞在相應的無血清培養基中經過10次傳代后，我們用顯微鏡評估了細胞的生長和形態。為了避免聚集體的出現和減小剪切力，我們從馴化開始就使用Pluronic?-F68并將細胞密度保持在2.5×106個細胞/mL以下。
經HyClone?培養基馴化的細胞符合我們設定的成功標準，即<10%聚集（<10個細胞的小聚集體）且細胞生長旺盛。我們創建了研究細胞庫和工作細胞庫（分別為RCB和WCB）。從創建的細胞庫中解凍HyCell?TransFx-H培養基中的冷凍保存細胞（請參閱材料和方法）。
細胞庫解凍與細胞生長比較
從細胞庫中解凍細胞（請參閱材料和方法) ，進行接種，并每周兩次傳代培養。
圖3所示為細胞形態的微觀結果分析(Evaluation) 。大多數細胞是活細胞并且處于單細胞懸浮狀態。

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圖3.在HyCell?TransFx-H培養基中培養的HEK293T細胞的單細胞懸浮