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圖二
圖二, 18個微珠群體的編碼 。 微珠群體由兩種不同的熒光染料以不同比例組合編碼 ， 并作為灰度值處理 。微球位于微孔板孔的透明底部便于對焦 。 微珠不需要固定 。 在每個加樣孔中 ， 可同時測量多個微珠群（多參數） 。 微珠成像通常使用10 9/0.30物鏡進行 ， 該物鏡能夠對直徑為6–30 微米的微珠進行成像 ， 在相機傳感器上創建直徑為9個像素的圖像（像素大小6.5 *6.5 微米） ， 這對于圖像處理來說是足夠的分辨率 。 由于景深僅為2.7 微米 ， 因此必須有自動算法進行自動對焦 。 理論上 ， 每個圖像覆蓋670 *900 微米的區域 ， 包含多達500個單個微珠 。 熒光激發的強度不是恒定的 ， TR-sWSI-Fluo只使用不同熒光通道之間的比率 ， 而不是絕對值 。 熒光染料的比例對于每個微珠群體都是特定的 。 此外還有直徑大小也用作分類參數 。 每個微珠群的表面用特定抗原/抗體/核酸修飾 ， 用來檢測樣品中的不同分析物 ， 此時使用與構成微珠的兩種熒光染料不同的第三種熒光染料染色 。 待檢測物的結合導致微珠周圍出現熒光光暈（圖三） 。 強度由圖像處理算法確定 。

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圖三-A
圖三-A. 單個微珠和其熒光標記的分析物（紅色光暈） 。 分析物的強度在微珠的邊緣進行測量或量化 。 微珠的身份鑒定通過其大小尺寸（直徑）和熒光顏色ID得到：

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圖三-B
圖三-B. 七種微珠log10群體混合后的圖像 ， 密度約為700 /mm2微球數 ， 紅色外圓=陽性 。 直徑和熒光顏色ID確保每個微珠分配給一個特定群體 ， 且具有唯一性 ， 使用這種方法的錯誤分類概率遠低于1% 。 如果兩種染料按1:10到10:1的比例對每個微珠進行編碼 ， 則可以計算-1到+1的熒光顏色ID 。TR-sWSI-FLUO應用于多重抗體（或抗原）檢測：

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圖四
圖四. 抗體（或抗原）微珠檢測方案 。 將攜帶不同抗原的三個微珠群1、2、3固定在微孔板上 。 抗體（例如特異性自身 ， 圖中標記一抗）僅與相應的抗原（微珠3表面的抗原）結合 。 一抗由熒光團標記的二抗體識別 ， 在微珠3表面產生不同于微球本身顏色（二種熒光的混合）的第三種熒光 。TR-sWSI-FLUO應用于多重PCR：

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圖五-A
圖五-A. 基于微珠雜交探針的多重PCR 。 3‘’端熒光標記的單鏈捕獲（通過核酸雜交）探針通過其5‘端’生物素與微珠表面的鏈霉親和素結合 。 “顯色探針”在其5°端標記有有淬火劑Q（Quencher） 。 在沒有PCR產物雜交的情況下 ， 保留捕獲探針和檢測探針在溶液中 ， 不會發生熒光能量共振轉移（FRET）熒光 。

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圖五-B
圖五-B. 基于微珠雜交探針的多重PCR 。 3‘’端熒光標記的單鏈捕獲（通過核酸雜交）探針通過其5‘端’生物素與微珠表面的鏈霉親和素結合 。 “顯色探針”在其5°端標記有有淬火劑Q（Quencher） 。 當PCR擴增產物隨著PCR反應進程其數量增加時 ， “顯色探針”和捕獲探針與PCR擴增產物雜交 ， 捕獲探針3‘端’的熒光標記和顯色探針5‘端的Q被安置在一起’而產生的FRET熒光（不同于微球和單鏈捕獲探針3‘端’的熒光）

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