小鼠心肌纖維化影響肥厚型心肌病方案設計分享——Apelin-13/Sphk1/S1P/Rho _健康小知識

肥厚型心肌病（HCM）是一種常染色體線性遺傳性性疾病，目前已證實，至少14個基因突變與肥厚型心肌病的發病有關，其中有10種是編碼肌小節結構蛋白的基因，絕大部分突變位于這些基因。其特征為非對稱性心肌肥厚，心肌細胞排列紊亂，間質纖維化，心臟舒張功能受損，是年輕人心臟性猝死的首位病因和心力衰竭的主要原因之一。
近年來大量研究表明，心肌纖維化可出現在高血壓、心肌梗死及心力衰竭等多種心血管疾病中，是心肌重構的主要表現之一。心肌纖維化是HCM典型的組織學改變，即有膠原纖維在細胞外沉積增加的間質纖維化，也包括了心肌壞死后瘢痕組織替代原有的細胞。研究還發現， Apelin-13在抑制環磷酸腺苷生成和促進細胞的趨化作用方面表現出更強的生物活性，在高血壓、冠心病及肺動脈高壓動物模型中均證實可以對抗心肌纖維化的發生，因此推測Apelin可能影響心肌纖維化的發生。
多種文獻研究已證實HCM中心肌纖維化擴展一定程度上與轉化生長因子β(TGF-β)激活成纖維細胞，促進膠原分子表達有關。在肺、皮膚及心肌成纖維細胞， TGF-β可以激活SphK1 ，進而使S1P表達及活性增加。 Rho和成纖維細胞的分化也有關聯， SphK1可以激活S1P ，與受體S1PR2結合后，激活Rho ，進而促進心肌成纖維細胞到肌纖維細胞的轉化，促進膠原纖維的形成。在主動脈縮窄致心衰模型的研究顯示， Apelin通過Sphk1/S1P通路抑制TGF-β介導的心肌成纖維細胞的分化，降低心室重構。因此綜上推測可能的再HCM中Apelin通過調控Sphk1/S1P/Rho從而在肌纖維化中發揮作用。
一、小鼠心肌纖維化細胞模型建立
方法1
（1）小鼠心肌細胞系H9c2
（2）cTnIR145G轉基因小鼠心肌細胞系H9c2
WB檢測cTnIR145G、CollIα1、TGFβ、β-肌球蛋白重鏈，證明心肌纖維化的模型簡歷成功；
方法2
（1）原代小鼠心肌細胞
（2）原代小鼠心肌細胞+AngⅡ10nmol/L,誘導48h;
（3）原代小鼠心肌細胞+AngⅡ100nmol/L,誘導48h;
（4）原代小鼠心肌細胞+AngⅡ1mmol/L,誘導48h;
WB檢測CollIα1、TGFβ、β-肌球蛋白重鏈，證明心肌纖維化的模型建立成功；
二、Apelin-13是否降低小鼠心肌細胞的纖維化反應
（1）cTnIR145G轉化的心肌細胞H9C2
（2）cTnIR145G轉化的心肌細胞H9C2+Apelin-13 ， 1nm+48h
（3）cTnIR145G轉化的心肌細胞H9C2+Apelin-13 ， 10nm+48h
（4）cTnIR145G轉化的心肌細胞H9C2+Apelin-13 ， 100nm+48h
（5）原代小鼠心肌細胞
（6）原代小鼠心肌細胞+AngⅡ100nmol/L,誘導48h;
（7）原代小鼠心肌細胞+AngⅡ100nmol/L+Apelin-1310nmol/L,誘導48h
（8）原代小鼠心肌細胞+AngⅡ100nmol/L+Apelin-13100nmol/L,誘導48h
WB檢測CollIα1和TGFβ ，確定最佳Apelin-13處理濃度。
三、Apelin-13處理心肌細胞是否影響下游信號基因SphK1/SIRT3/AMPK以及細胞凋亡
（1）cTnIR145G轉化的心肌細胞H9C2
（2）cTnIR145G轉化的心肌細胞H9C2+Apelin-13 ， 100nm+48h
（3）原代小鼠心肌細胞
（4）原代小鼠心肌細胞+AngⅡ100nmol/L+Apelin-13100nmol/L,誘導48h
檢測
（1）QPCR檢測：CollIα1和SphK1、SIRT3；
（2）WB檢測：β-肌球蛋白重鏈、SphK1、SIRT3、Fox03a、p-Fox03a、AMPK、p-AMPK、Bax、Bcl-2；
（3）免疫熒光檢測：β-肌球蛋白重鏈， αSMA；
（4）檢測細胞內ROS含量和ATP含量；
（5）流式細胞儀檢測細胞凋亡；
四、Apelin-13降低心肌細胞的纖維化反應是否通過SphK1/S1P/Rho途徑
（1）cTnIR145G轉化的心肌細胞
（2）cTnIR145G轉化的心肌細胞+siRNA-S1P2