環形RNA（circRNA）是一類共價閉環的單鏈RNA ， 細胞內大多數circRNA是由mRNA前體的外顯子通過反向剪接形成 。 除反向剪接位點（BSJ）外 ， circRNA在序列上與其同源的線形RNA在一級序列上完全一致 ， 因此 ， 在研究circRNA功能時如何將其與同源線性RNA的功能區分開來是領域中的一個難題 。
近日 ， 中國科學院分子細胞科學卓越創新中心陳玲玲在Nature子刊NatureProtocols上發表了題為：ScreeningcircularRNAswithfunctionalpotentialusingtheRfxCas13d/BSJ-gRNAsystem的論文 。 該論文詳細介紹了團隊近期建立的基于CRISPR–Cas13技術的circRNA篩選新方法 。
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基于CRISPR–Cas13技術的環形RNA功能篩選流程
2020年12月7日 ， 陳玲玲、楊力、李勁松團隊合作 ， 在NatureMethods期刊發表了題為：ScreeningforfunctionalcircularRNAsusingtheCRISPR–Cas13system的研究論文 ， 開發了一種基于CRISPR-Cas13d的篩選工具 ， 能夠快速篩選和發現功能性circRNA 。
該研究開發并優化了CRISPR–RfxCas13d ， 通過gRNA靶向circRNA的反向剪接位點（BSJ） ， 可有效區分circRNA與線性mRNA ， 能夠特異性敲除靶標環形RNA ， 而不影響其同源線性RNA的表達 。
基于該技術 ， 研究團隊構建了靶向人類高表達circRNA的反向剪接位點序列的慢病毒文庫 ， 使用該篩選文庫 ， 研究團隊發現了一組對細胞生長、胚胎發育等有重要作用的功能性circRNA 。
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基于CRISPR–Cas13在circRNA功能研究上的技術突破 ， 陳玲玲團隊受NatureProtocols期刊邀請詳細介紹該技術的實驗方法和流程 ， 以期推動該技術在circRNA功能研究領域的應用 。
在該實驗方法中 ， 研究團隊詳細描述了針對circRNABSJ位點的gRNA文庫設計和構建 ， RfxCas13d穩定表達細胞系構建 ， 細胞水平和體內水平的功能性circRNA篩選以及篩選結果的計算分析流程等等 。 同時還對實驗過程中可能遇到的問題以及注意事項進行了詳細闡明 。 該方法不僅為circRNA的功能研究提供助力 ， 也為深入理解circRNA奠定新的技術基礎 。 中科院分子細胞卓越中心原副研究員李斯琪、副研究員烏皓為論文共同第一作者 ， 陳玲玲研究員為論文通訊作者 。 （來源inature）返回搜狐 ， 查看更多
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